史佩玉 高帥 綦向軍 莫嘉浩 張喚喚 朱俊霞 陳國銘 林樫 方彩珊 徐福平

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 5104052.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 5104053.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院治未病中心，廣東 廣州 510120

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見的骨骼疾病，主要以骨量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，進(jìn)而導(dǎo)致骨脆性增加，容易發(fā)生骨折為特征的全身性骨骼疾病[1]。骨質(zhì)疏松癥在祖國醫(yī)學(xué)中屬于“痿”“骨痹”“骨枯”的范疇，主要的病機(jī)為腎精虧虛，髓海空虛，骨失濡養(yǎng)，是一種全身骨骼的慢性退行性疾病[2]。典型的臨床表現(xiàn)為脊柱變形、疼痛、發(fā)生脆性骨折。骨質(zhì)疏松癥是一種年齡相關(guān)性疾病，隨著當(dāng)今社會醫(yī)療條件的提高，人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥逐漸成為一個(gè)社會所公認(rèn)的嚴(yán)峻問題，嚴(yán)重影響了老年人的生活質(zhì)量[3-5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年中國60歲以上的老年人骨質(zhì)疏松患病率為36%，其中男性為23%，女性為49%[6]。目前，抗骨質(zhì)疏松癥的藥物按照其作用機(jī)制主要有骨吸收抑制劑、骨形成促成劑和其他機(jī)制類藥物[7]，但這些藥物只能緩解患者的臨床癥狀，并不能從根本上改善骨代謝的情況，也不能調(diào)節(jié)成骨和破骨過程的動態(tài)平衡，長期使用會存在一定的副作用，同時(shí)對于有某些基礎(chǔ)病患者臨床的使用也有一定的限制[8]。目前，中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥的療效逐漸被患者所認(rèn)可，引起了當(dāng)今國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[9-10]。

二仙湯是張伯納教授于20世紀(jì)50年代研制出的名方，以溫補(bǔ)腎陽，補(bǔ)益腎精，瀉相火，調(diào)理沖任為主要功效，全方由仙茅、仙靈脾(淫羊藿)、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母六味中藥組成，溫而不燥，寒而不滯，具有調(diào)和陰陽之效[11]，對于骨質(zhì)疏松癥有良好的防治作用[12-14]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，二仙湯可以通過多種途徑作用于人體，明顯改善骨質(zhì)疏松癥，可能的機(jī)制之一是調(diào)節(jié)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白，影響成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞的增殖分化，提高血鈣水平，促進(jìn)骨形成的同時(shí)抑制骨吸收以此來維持骨量[15-17]。也可以通過下調(diào)生物氧化相關(guān)蛋白來發(fā)揮抗氧化的作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白，保護(hù)細(xì)胞，從而預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[18]。但是，二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥有效成分繁雜，涉及靶點(diǎn)通路眾多，起效機(jī)制復(fù)雜，傳統(tǒng)藥理學(xué)難以進(jìn)行系統(tǒng)的分析。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的新興和發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為研究藥物作用機(jī)制的新方法，從整體的角度探索藥物與疾病之間的關(guān)系，系統(tǒng)綜合地分析藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，從而揭示藥物系統(tǒng)作用于人體的機(jī)制，與中醫(yī)學(xué)整體觀念、辨證論治的思想相契合，同時(shí)與中藥方劑多途徑、多靶點(diǎn)的治療原理一致[19-20]。本文擬運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探究二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，為骨質(zhì)疏松癥的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 二仙湯活性成分與作用靶標(biāo)預(yù)測

以“仙茅”“淫羊藿”“巴戟天”“當(dāng)歸”“黃柏”“知母”6味中藥作為Herb name在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中檢索二仙湯活性成分，并通過設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(druglikeness，DL)≥0.18[21]來進(jìn)行活性成分的篩選。OB是指藥物進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的程度和速度，是客觀評價(jià)藥物內(nèi)在質(zhì)量的重要指標(biāo)，活性成分的OB值越高代表其用于臨床的可能性就越大；DL常用于分析藥物活性結(jié)果、預(yù)測體內(nèi)藥代動力學(xué)、評價(jià)藥物分子成藥性的優(yōu)劣程度[22]。運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫查找篩選所得活性成分對應(yīng)的作用靶標(biāo)信息，并將作用靶標(biāo)信息輸入到Uniprot(https://www.uniprot.org)中獲取其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 骨質(zhì)疏松癥基因檢索

通過TTD(https://db.idrblab.org)、Genecards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://www.omim.org)、DisGeNET(http://www.disgenet.org)在線數(shù)據(jù)庫，設(shè)置關(guān)鍵詞為“Osteoporosis”進(jìn)行骨質(zhì)疏松癥基因檢索，將4個(gè)在線數(shù)據(jù)庫中獲得的基因匯總后去重，即得到骨質(zhì)疏松癥基因。

1.3 構(gòu)建“二仙湯藥物-活性成分-交集靶標(biāo)基因”網(wǎng)絡(luò)圖

獲得二仙湯作用靶標(biāo)與骨質(zhì)疏松癥基因后，取兩者的交集靶標(biāo)基因，與二仙湯活性成分、藥物一一對應(yīng)，并采用Cytoscape3.7.0軟件(http：//cytoscape.org/)構(gòu)建“二仙湯藥物-活性成分-交集靶標(biāo)基因”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 二仙湯-骨質(zhì)疏松癥交集靶標(biāo)基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因的篩選

將二仙湯-骨質(zhì)疏松癥交集靶標(biāo)基因輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為最高置信度“highest confidence(0.900)”，并隱藏PPI網(wǎng)絡(luò)中無關(guān)聯(lián)的靶標(biāo)基因，得到PPI網(wǎng)絡(luò)信息，再運(yùn)用Cytoscape3.7.0軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化處理。關(guān)鍵基因是基于蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)得到的，在相關(guān)通路中具有調(diào)控其他基因作用的重要基因[23]。由于使用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建蛋白(基因)相互作用網(wǎng)絡(luò)后，較多的蛋白/基因節(jié)點(diǎn)-節(jié)點(diǎn)間的連線常常會掩蓋住關(guān)鍵基因，本研究擬運(yùn)用CytoHubba插件中的MCC、Closeness、EcCentricity、Degree、Stress等算法進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析尋找關(guān)鍵基因[24]。MCC算法在預(yù)測基因方面發(fā)揮著重要的作用，具有更大的優(yōu)勢[23]，故本研究采用CytoHubba插件中的MCC算法，篩選二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵基因，MCC數(shù)值越高，代表節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.5 GO分析和KEGG通路富集分析

將篩選出的二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵基因?qū)氲絞:Profiler網(wǎng)站(http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析。根據(jù)富集基因數(shù)進(jìn)行排序，選取排名在前20的生物途徑(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)和骨質(zhì)疏松癥相關(guān)信號通路，使用Omicshare工具(http://www.omicshare.com/tools/)繪制高級氣泡圖。最后運(yùn)用R軟件繪制靶標(biāo)-通路機(jī)制干預(yù)圖。

2 結(jié)果

2.1 二仙湯活性成分與作用靶標(biāo)預(yù)測結(jié)果

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18作為篩選條件，共篩選得到二仙湯活性成分104種，其中仙茅包括環(huán)木菠蘿烯酸(cycloartenol)、仙茅皂甙C(curculigosaponin C)等7種；淫羊藿包括乙酸亞油醇酯(linoleyl acetate)、淫羊藿苷(Icariln)等23種；巴戟天包括槲皮素(quercetin)、茜草素-2-甲醚(alizarin-2-methylether)等20種；當(dāng)歸包括β-谷甾醇 (beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)等2種；黃柏包括小檗堿(berberine)、廣玉蘭內(nèi)酯(magnograndiolide)等37種；知母包括山柰酚(kaempferol)、薯蕷皂甙元(diosgenin)等15種。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和Uniprot共預(yù)測得到二仙湯靶標(biāo)基因224個(gè)(部分活性成分沒有作用靶標(biāo))。

2.2 “二仙湯藥物-活性成分-交集靶標(biāo)基因”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

在TTD、Genecards、OMIM、DisGeNET在線數(shù)據(jù)庫中檢索骨質(zhì)疏松癥基因，去重后取并集共獲得骨質(zhì)疏松癥基因3 633個(gè)，與二仙湯靶標(biāo)基因交集映射，共得到二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥交集靶標(biāo)基因145個(gè)?！岸蓽袠?biāo)基因-骨質(zhì)疏松癥基因”韋恩圖見圖1。構(gòu)建“二仙湯藥物-活性成分-交集靶標(biāo)基因”網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖2。該網(wǎng)絡(luò)由217個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 656條邊組成，粉紅色圓形節(jié)點(diǎn)代表交集靶標(biāo)基因，淺綠色八邊形節(jié)點(diǎn)代表二仙湯活性成分，青色菱形節(jié)點(diǎn)代表二仙湯藥物。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果，槲皮素、山柰酚、淫羊藿苷等活性成分顯著性較高，在網(wǎng)絡(luò)中起重要作用。由圖2可知，一種活性成分可作用于多個(gè)交集靶標(biāo)基因，一個(gè)交集靶標(biāo)基因也可由多種活性成分所擁有，各活性成分與交集靶標(biāo)基因間相互作用聯(lián)系，體現(xiàn)了二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥涉及多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

圖2 “二仙湯藥物-活性成分-交集靶標(biāo)基因”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network of “Erxian decoction-active ingredient-intersecting target genes”

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因篩選結(jié)果

根據(jù)CytoHubba插件中的MCC算法篩選出JUN、TNF、RELA等排名在前50的關(guān)鍵基因，詳見表1。構(gòu)建二仙湯-骨質(zhì)疏松癥交集靶標(biāo)基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖3。該網(wǎng)絡(luò)由132個(gè)節(jié)點(diǎn)和582條邊組成(由于在STRING數(shù)據(jù)庫中設(shè)置隱藏?zé)o關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)，故有13個(gè)交集靶標(biāo)基因未參與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建)，圖3中50個(gè)八邊形節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵基因，82個(gè)菱形節(jié)點(diǎn)代表非關(guān)鍵基因，節(jié)點(diǎn)顏色由淺黃到深紅說明其MCC數(shù)值越高，在網(wǎng)絡(luò)中的作用越顯著。

圖3 “二仙湯-骨質(zhì)疏松癥交集靶標(biāo)基因PPI”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network of “Erxian decoction-OP intersecting target genes”

表1 關(guān)鍵基因信息Table 1 Information of the key genes

2.4 關(guān)鍵基因GO分析結(jié)果

GO分析結(jié)果顯示，二仙湯-骨質(zhì)疏松癥關(guān)鍵基因參與的生物途徑主要包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、生物過程的陽性調(diào)節(jié)(positive regulation of biological process)等；關(guān)鍵基因主要調(diào)控的細(xì)胞組分為胞內(nèi)細(xì)胞器腔(intracellular organelle lumen)、核漿(nucleoplasm)等；分子功能主要包括酶結(jié)合(enzyme binding)、信號受體結(jié)合(signaling receptor binding)等，詳見圖4～6。

圖4 關(guān)鍵基因生物途徑圖Fig.4 Biological process of the intersecting target genes

圖5 關(guān)鍵基因細(xì)胞組分圖Fig.5 Cell components of the intersecting target genes

圖6 關(guān)鍵基因分子功能圖Fig.6 Molecular function of the intersecting target genes

2.5 關(guān)鍵基因KEGG通路富集結(jié)果

如圖7所示，二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥關(guān)鍵基因主要涉及PI3K-Akt信號通路、NF-kappa B信號通路、TNF信號通路、Wnt信號通路、雌激素信號通路等。運(yùn)用R軟件對PI3K-Akt信號通路和TNF信號通路進(jìn)行靶標(biāo)-通路分析，圖中紅色標(biāo)記代表二仙湯可能干預(yù)的潛在作用靶標(biāo)，詳見圖8、圖9。

圖7 關(guān)鍵基因KEGG通路富集圖Fig.7 KEGG pathways of the intersecting target genes

圖9 TNF信號通路機(jī)制圖Fig.9 Machine drawing of TNF signaling pathway

3 討論

二仙湯由仙茅、仙靈脾(淫羊藿)、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母等六味中藥組成，其在提高骨密度，改善緩解疼痛，以及防治骨質(zhì)疏松癥方面有獨(dú)特的優(yōu)勢[25]。二仙湯中所含活性成分主要包括淫羊藿苷、槲皮素、山柰酚等黃酮類化合物。淫羊藿苷是淫羊藿用于治療骨質(zhì)疏松癥的主要活性成分，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和抑制破骨細(xì)胞骨吸收的雙重作用，在預(yù)防骨量丟失方面發(fā)揮著重要作用[26]。相關(guān)研究表明，淫羊藿苷可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與分化，增加鈣鹽的沉積，促進(jìn)骨的生成[27]；同時(shí)，淫羊藿苷能夠調(diào)控OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)，抑制核因子κB受體激活因子配體(receptor activator for NF-κBligand，RANKL)與破骨細(xì)胞標(biāo)志物核因子κB受體激活因子(nuclear factor kappa-B，RANK)的結(jié)合，上調(diào)OPG/RANKL的比值，減少破骨細(xì)胞的生成與活化[28]。王艷[29]通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素亦能夠上調(diào)骨組織中OPG的表達(dá)，下調(diào)RANKL的表達(dá)，降低破骨細(xì)胞的生成，減少骨吸收。上述二仙湯中兩種重要的活性成分發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制均與OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)相關(guān)，這與近年來的研究一致[30-31]。山柰酚可以起到雌激素類作用，顯著增加絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨密度，提高骨礦物質(zhì)含量，改善骨微結(jié)構(gòu)，緩解骨質(zhì)疏松癥狀[32]。

由圖2“二仙湯藥物-活性成分-交集靶標(biāo)基因”網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果可知，二仙湯各藥物中所含活性成分可以作用于多個(gè)靶標(biāo)基因，并且JUN、TNF-α、IL6、AR等多個(gè)靶標(biāo)基因也與多個(gè)二仙湯活性成分有相互作用，表明二仙湯各活性成分與靶標(biāo)基因之間存在著協(xié)同作用。JUN基因是快速反應(yīng)基因，可對外界刺激做出迅速反應(yīng)，為JAK-STAT信號通路上的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化[33]。TNF-α為炎癥發(fā)生早期出現(xiàn)的重要炎癥因子，通過激活NF-κB促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成，增強(qiáng)破骨細(xì)胞骨吸收，為骨質(zhì)疏松癥的上調(diào)基因[34]。因此，筆者推測通過下調(diào)骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)TNF-α水平，可以下調(diào)RANKL的表達(dá)，減少破骨細(xì)胞的生成，起到防治骨質(zhì)疏松癥的目的。IL6為重要的炎癥因子，趙旭等[35]發(fā)現(xiàn)通過早期下調(diào)IL6水平，可以抑制破骨細(xì)胞活化，減少骨吸收。雄激素在男性骨骼生長與骨量保持中發(fā)揮重要作用，雄激素水平降低會導(dǎo)致骨量減少，骨密度下降，誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥[36]。AR為雄激素受體，與雄激素結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核，直接調(diào)控靶基因的表達(dá)，并具有調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的功能，其調(diào)控骨代謝涉及多條信號通路：一方面可以調(diào)控經(jīng)典wnt信號通路等，促進(jìn)骨的生成；另一方面又可以調(diào)控RANKL/OPG信號通路等，抑制骨的吸收[37]。上述二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵基因調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的增殖與分化、信號受體結(jié)合等多種生物途徑和分子功能，與本研究GO富集結(jié)果相一致。

KEGG信號通路富集結(jié)果顯示PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、NF-kB信號通路、TNF信號通路、Wnt信號通路、雌激素信號通路富集較多關(guān)鍵基因，可能是二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵信號通路。堿性磷酸酶(ALP)是早期成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志，活化PI3K-Akt信號通路可以增強(qiáng)ALP的活性，刺激成骨細(xì)胞的增殖與分化，抑制成骨細(xì)胞的凋亡[38-39]。MAPK信號通路的下游信號通路包括ERK通路、JNK通路、P38通路等，其中ERK通路可維護(hù)骨代謝平衡，JNK通路影響骨的形成，P38通路促進(jìn)成骨細(xì)胞生成并可抑制破骨細(xì)胞分化[40]。PI3K-Akt信號通路與MAPK信號通路間關(guān)系密切，具有協(xié)同作用，共同調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[41]。破骨細(xì)胞的激活依賴于核因子kB受體激活因子配體RANKL與RANK的結(jié)合，進(jìn)而活化NF-kB信號通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化[42]，通過下調(diào)NF-kB信號通路，能夠抑制破骨細(xì)胞分化，是二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥的重要信號通路。RANK是RANKL的唯一受體，為TNF受體家族中的一員，TNF-α可以增加RANKL的表達(dá)，誘發(fā)破骨細(xì)胞分化[34， 42]。由此可見，OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞與NF-kB信號通路、TNF信號通路密切相關(guān)，也印證了二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥的信號通路間相互聯(lián)系，起協(xié)同作用。經(jīng)典的Wnt信號通路可以直接作用于Runx2促進(jìn)骨的形成，亦可以通過增強(qiáng)ALP的活性間接起到成骨作用[43-44]，非經(jīng)典的Wnt信號通路具有促進(jìn)成骨和抑制成骨的雙向調(diào)節(jié)作用[45]。雌激素可以匯聚Wnt信號通路、蛋白激酶通路、BMP-2信號通路等共同調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[46]。相關(guān)研究表明，Toll樣受體信號通路[47]、HIF-1信號通路[48]、JAK-STAT信號通路[49]等亦可以直接或間接調(diào)節(jié)骨代謝而起到治療骨質(zhì)疏松癥的作用。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)二仙湯中的淫羊藿苷、槲皮素、山柰酚等活性成分可能通過JUN、TNF-α、IL6、AR等多個(gè)關(guān)鍵基因富集于PI3K-Akt、MAPK、NF-kB、TNF、Wnt、雌激素等信號通路，起到調(diào)節(jié)骨代謝，促進(jìn)成骨細(xì)胞生成和抑制破骨細(xì)胞分化，治療骨質(zhì)疏松癥的目的。但在實(shí)際運(yùn)用中，二仙湯各中藥在煎煮過程中活性成分可能會發(fā)生改變，目前雖無相關(guān)文獻(xiàn)對此進(jìn)行研究，但亦不容忽略，有待進(jìn)一步研究。