段家樂，張曉敏，孟鵬飛，鄭輯英

缺血性腦卒中主要是因腦部供血動脈狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的總稱，又被稱之為腦梗死，病人常伴有頭暈、手腳麻木等癥狀，嚴(yán)重者會出現(xiàn)肢體功能障礙、語言障礙，甚至死亡。因此，分析出現(xiàn)缺血性腦卒中的危險因素，并給予針對性干預(yù)，對降低缺血性腦卒中致殘率、致死率極為重要[1-2]。有報道指出，肥胖是腦卒中出現(xiàn)的主要誘因，肥胖者往往存在血脂、血壓升高，會增加病人出現(xiàn)粥樣硬化性斑塊的危險性，從而增加罹患缺血性腦卒中的風(fēng)險[3]。血漿纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)含量也與缺血性腦卒中的出現(xiàn)存在密不可分的關(guān)系，F(xiàn)gβ-148C/T是調(diào)控機體分泌Fg的主要基因，當(dāng)該基因出現(xiàn)突變時會影響Fg的分泌，使機體凝血反應(yīng)出現(xiàn)異常[4]。本研究通過分析腦卒中病人及健康受試者的Fgβ-148C/T基因多態(tài)性及體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)，旨在探究其與缺血性腦卒中發(fā)生的關(guān)系，并分析影響缺血性腦卒中發(fā)生的危險因素，為該疾病的治療及預(yù)防提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月—2018年5月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院收治的缺血性腦卒中病人120例為缺血性腦卒中組，并以同期健康體檢者80名為健康對照組。缺血性腦卒中組120例，男71例，女49例，年齡45～76(58.16±7.93)歲；健康對照組80名，男49名，女31名；年齡42～75(57.24±8.05)歲。兩組受試者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過。

1.2 缺血性腦卒中病人納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》關(guān)于缺血性腦卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②為首次出現(xiàn)缺血性腦卒中；③病人知情同意并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①嚴(yán)重心、肝、腎功能異常病人；②出血性腦卒中病人；③腦腫瘤病人；④有顱腦手術(shù)史病人；⑤其他腦部疾病病人。

1.4 方法

1.4.1 Fgβ-148C/T基因多態(tài)性 ①標(biāo)本采集：取病人入院后24 h內(nèi)空腹靜脈血5 mL，于4 ℃環(huán)境下，放置于EDTA抗凝無菌試管中保存待用。②DNA提取：在1.5 mL試管中加入750 μL細(xì)胞裂解液+300 μL枸櫞酸鈉抗凝劑，多次混勻，然后進(jìn)行離心處理，10 000 r/min離心20 s，取下層白色沉淀物，加入150 μL緩沖液(Fg與蛋白酶K的混合液)，混勻震蕩至沉淀物溶解，在65 ℃水浴環(huán)境下反應(yīng)10 min，然后加入150 μL異丙醇，使其反應(yīng)至出現(xiàn)絲狀基因組DNA后進(jìn)行離心處理3 min，棄上清液。在沉淀物中加入70%乙醇150 μL，應(yīng)用離心機離心處理3 min，保留下層沉淀物，重復(fù)此操作2次，將多余液體揮發(fā)干凈后加入緩沖液TB 200 μL，低速渦旋5 s，在65 ℃水浴鍋中加熱30 min左右，加熱過程中輕輕敲打試管幫助溶解，完成后放置于4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?。③PCR擴增：Fgβ-148C/T引物序列，上游引物5′-CGTAACTTCCCATCATTTTGTC-3′， 下游引物5′-ATGGTTTTAAGTTTGTGGAAGC-3′，反應(yīng)體系參照黃桂鳳等[6]研究，混勻后用50 μL液狀石蠟油，共反應(yīng)35個循環(huán)(94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s)，反應(yīng)完成后放置于4 ℃環(huán)境下。④多態(tài)性分析：取10 μL PCR產(chǎn)物在37 ℃環(huán)境下加入0.2 μL 牛血清白蛋白(BSA)、2 μL Buffer、3.8 mL 雙蒸水(ddH2O)、1 μL 10 U/μL 限制性內(nèi)切酶(HindⅢ)，孵育3 h后，采用瓊脂凝膠電泳30 min，應(yīng)用紫外檢測儀分析電泳結(jié)果。

1.4.2 BMI測定 于病人入院24 h內(nèi)，應(yīng)用身高、體重測量儀器檢測病人身高、體重，計算BMI=體重(kg)/身高(m)2。

1.5 觀察指標(biāo) ①分析Fg基因多態(tài)性在健康對照組及缺血性腦卒中組中的分布特點及與缺血性腦卒中發(fā)生的關(guān)系。②比較兩組受試者BMI，分析肥胖(BMI≥28 kg/m2)與缺血性腦卒中發(fā)生的關(guān)系。③收集病人一般資料，主要包括吸煙(平均≥1支/日)、飲酒(每周≥120 mL)、腦卒中家族史(直系親屬中有患腦卒中者)、高血壓史[連續(xù)3次檢測血壓均≥140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或開始服用相關(guān)降壓藥物]、糖尿病病史(空腹血糖≥7 mmol/L或餐后血糖≥10 mmol/L，開始服用降糖藥物)、高脂血癥病史(開始服用降脂藥物)、心臟病史(心肌缺血、心肌梗死、冠心病等)等，采用多元Logistics回歸分析影響缺血性腦卒中發(fā)生的危險因素。

2 結(jié) 果

2.1 兩組Fgβ-148C/T基因多態(tài)性分布 在Fgβ-148C/T基因中，缺血性腦卒中組CT基因型頻率及C等位基因頻率低于健康對照組(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組Fgβ-148C/T基因多態(tài)性分布 單位：例(%)

2.2 兩組BMI比較 缺血性腦卒中組BMI為(27.53±3.12)kg/m2，高于健康對照組的(23.59±2.37)kg/m2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.596，P=0.000)。

2.3 相關(guān)性分析 Fgβ-148C/T基因中T基因出現(xiàn)頻率、BMI值與缺血性腦卒中發(fā)生呈正相關(guān)(r=0.166，P=0.000；r=0.620，P=0.000)。

2.4 缺血性腦卒中的危險因素分析 腦卒中家族史、肥胖、Fgβ-148C/T基因多態(tài)性、高血壓、糖尿病、高脂血癥、心臟病是缺血性腦卒中發(fā)生的獨立危險因素(P<0.05)。詳見表2。

表2 缺血性腦卒中的危險因素分析

3 討 論

Fg又稱為凝血因子1，是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質(zhì)，是纖維蛋白的前體，具有雙重生物活性，既是凝血酶作用的底物，參與凝血反應(yīng)的過程，又是纖溶酶的靶物質(zhì)，在凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，并且血漿Fg含量過高時會與血小板膜糖蛋白結(jié)合，導(dǎo)致血小板聚集，促進(jìn)血栓的形成，影響血液循環(huán)過程，從而增加病人出現(xiàn)缺血性腦卒中的危險性[7]。有報道指出，F(xiàn)gβ-148C/T基因多態(tài)性與血漿Fg水平存在密不可分的聯(lián)系，且其是影響基因轉(zhuǎn)錄的重要位點[8]。Fgβ-148C/T位于Fgβ基因5′端啟動區(qū)，主要受皮質(zhì)激素及肝細(xì)胞刺激因子的調(diào)控，與紅細(xì)胞的生理功能及血小板、白細(xì)胞的生成相關(guān)，而缺血性腦卒中病人普遍存在血小板異常聚集的現(xiàn)象，會影響機體激素代謝和炎癥反應(yīng)過程，從而導(dǎo)致Fgβ-148C/T基因突變[9-10]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)gβ-148C/T基因中，缺血性腦卒中組CT基因型頻率及C等位基因頻率低于健康對照組，說明缺血性腦卒中病人Fgβ-148C/T基因中CT基因型頻率及C等位基因頻率偏低，這提示Fgβ-148C/T基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的發(fā)生過程有關(guān)。Fgβ-148C/T基因突變時會改變細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子與對應(yīng)位點的親和力，影響Fg轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致Fg分泌異常[11]。而缺血性腦卒中病人因普遍存在血漿Fg水平偏高的現(xiàn)象，這可能與Fgβ-148C/T多態(tài)性有關(guān)。黃華佗等[12]研究表明，F(xiàn)gβ-148C/T基因型與頸動脈粥樣硬化的程度有關(guān)，而頸動脈粥樣硬化是誘發(fā)缺血性腦卒中的主要原因，這表明Fgβ-148C/T基因多態(tài)性可能與缺血性腦卒中的發(fā)生過程有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gβ-148C/T基因多態(tài)性是影響缺血性腦卒中發(fā)生的獨立危險因素，F(xiàn)gβ-148C/T基因中T基因出現(xiàn)頻率與缺血性腦卒中發(fā)生呈正相關(guān)，這表明可通過檢測病人Fgβ-148C/T基因多態(tài)性來初步預(yù)測缺血性腦卒中的發(fā)生概率。缺血性腦卒中是指腦血管發(fā)生堵塞造成腦局部組織功能喪失引起的臨床一系列綜合征[13]。BMI的增加會導(dǎo)致血壓增高、脈壓增大，并且會導(dǎo)致血壓變異性增加，過度脂肪堆積也會導(dǎo)致動脈血管彈性減退，影響血管內(nèi)皮功能，從而使發(fā)生腦卒中的危險性增加[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中組BMI值高于健康對照組，BMI值與缺血性腦卒中發(fā)生呈正相關(guān)，說明病人BMI值越高，出現(xiàn)缺血性腦卒中的概率越大，這表明肥胖可能與病人出現(xiàn)缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)。本研究進(jìn)一步證實肥胖是影響缺血性腦卒中發(fā)生的危險因素，這主要是因為肥胖病人往往伴有血脂、血壓過高，且其動脈硬化程度較為嚴(yán)重，使血脂堆積于血管壁造成管腔狹窄，最終導(dǎo)致腦血管堵塞，影響腦組織內(nèi)血液流通，進(jìn)而誘發(fā)缺血性腦卒中。

相關(guān)報道指出，患有糖尿病、高脂血癥等基礎(chǔ)疾病的病人出現(xiàn)缺血性腦卒中的概率高于健康人群，提示基礎(chǔ)疾病可能與缺血性腦卒中的發(fā)生過程有關(guān)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病、高脂血癥、心臟病是影響缺血性腦卒中發(fā)生的獨立危險因素，這主要是因為糖尿病不僅會影響血液微循環(huán)，而且會使大腦、眼球等部位毛細(xì)血管基底膜增厚，而高脂血癥、心臟病會影響血小板的黏附和凝聚，加重動脈粥樣硬化程度，導(dǎo)致缺血性腦卒中發(fā)生的危險性升高。

綜上所述，病人Fgβ-148C/T基因中T基因出現(xiàn)頻率、BMI值與出現(xiàn)缺血性腦卒中呈正相關(guān)，腦卒中家族史、肥胖、Fgβ-148C/T基因多態(tài)性、高血壓、糖尿病、高脂血癥、心臟病是影響缺血性腦卒中發(fā)生的獨立危險因素。因此，可通過控制血壓、血糖、血脂及BMI值來降低缺血性腦卒中發(fā)生的危險性。