嚴(yán)宇青 陳豪燕 洪 潔 王震華

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所(200001)

背景：LncRNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其在腫瘤中表達(dá)和調(diào)控異常具有較高的特異性。目的：利用Cancer LncRNome數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)直腸癌中差異表達(dá)的lncRNA，并探討LINC02363在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法：提取Cancer LncRNome數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌患者芯片數(shù)據(jù)，篩選結(jié)直腸癌差異表達(dá)的lncRNA。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞株和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院53例結(jié)直腸癌組織中LINC02363表達(dá)。分析基于TCGA數(shù)據(jù)庫的LINC02363表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存期和臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果：共篩選出與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)的2條表達(dá)上調(diào)的lncRNA和12條表達(dá)下調(diào)的lncRNA。與正常腸上皮細(xì)胞相比，LINC02363在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。LINC02363在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著降低。LINC02363低表達(dá)組生存期顯著短于LINC02363高表達(dá)組，LINC02363低表達(dá)與結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。結(jié)論：LINC02363在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，低表達(dá)LINC02363的結(jié)直腸癌患者預(yù)后差、轉(zhuǎn)移可能性大。提示LINC02363有可能作為評估結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的新型腫瘤標(biāo)志物。

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居惡性腫瘤第三位，病死率居第四位，是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1-2]。由于飲食習(xí)慣和生活方式發(fā)生改變，近年我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升。結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和治療后復(fù)發(fā)是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要因素[3-5]。為了早期診斷結(jié)直腸癌、遏制其發(fā)展進(jìn)程、改善患者的預(yù)后，亟待尋找新的腫瘤標(biāo)志物。結(jié)直腸癌是涉及基因組學(xué)的多步驟改變的遺傳疾病，與蛋白編碼基因(PCG)相比，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)的表達(dá)和調(diào)控異常具有更高的腫瘤特異性[6]。LncRNA可作為支架來調(diào)節(jié)蛋白-蛋白或蛋白-DNA之間的相互作用；可作為誘餌結(jié)合蛋白或microRNA；可作為增強(qiáng)子影響基因轉(zhuǎn)錄；還可通過染色質(zhì)修飾，在生理和病理?xiàng)l件下調(diào)控表觀遺傳[7-11]。

Cancer LncRNome數(shù)據(jù)庫(The Cancer LncRNome Atlas)是基于對癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)錄、基因組和表觀遺傳水平的lncRNA改變進(jìn)行多平臺(tái)整合分析而得到的數(shù)據(jù)庫，涵蓋13種癌癥、5 037例人類腫瘤標(biāo)本[12]。本研究通過提取Cancer LncRNome數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌差異表達(dá)的lncRNA，將其與TCGA數(shù)據(jù)庫中的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，旨在篩選結(jié)直腸癌中差異表達(dá)的lncRNA，并探討LINC02363在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其意義，進(jìn)一步分析其與結(jié)直腸癌診斷、腫瘤轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。

材料與方法

一、資料收集

1.Cancer LncRNome數(shù)據(jù)庫：提取該數(shù)據(jù)庫中含有結(jié)直腸癌組織與正常結(jié)直腸組織芯片的數(shù)據(jù)，在RNA水平比較差異表達(dá)的lncRNA。

2.TCGA數(shù)據(jù)庫：提取TCGA數(shù)據(jù)庫中含有結(jié)直腸癌組織芯片和正常結(jié)直腸組織芯片的數(shù)據(jù)以及患者的臨床資料和預(yù)后信息。臨床資料包括患者的性別、初次病理診斷年齡、疾病AJCC臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、脈管侵及、結(jié)腸息肉病史、治療后復(fù)發(fā)情況。

二、標(biāo)本來源

選擇2016年1月—2017年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院53例結(jié)直腸癌手術(shù)患者，從癌組織中央非壞死區(qū)域取材，經(jīng)兩位高年資消化病理科醫(yī)師診斷為結(jié)直腸癌。本研究方案已獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

三、細(xì)胞株、主要試劑

人正常結(jié)直腸黏膜FHC細(xì)胞、人結(jié)直腸癌細(xì)胞株均購于美國菌種保藏中心(ATCC)。RPMI-1640培養(yǎng)基、McCoy’s 5A培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司。Trizol試劑、PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq均購自日本Takara公司。ENSG00000180712、ENSG00000229649、ENSG00000 246089特異性引物和內(nèi)參GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

四、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW1116、SW480、DLD-1、RKO和LoVo用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29和HCT116用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，人結(jié)直腸癌細(xì)胞株Caco-2用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以上細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞和組織中LINC02363表達(dá)：結(jié)直腸癌細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌兩次，取60 mg結(jié)直腸癌組織研磨成粉末，加入1 mL Trizol試劑提取RNA。取1 μg RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-△△Ct法評估基因的相對表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參。GAPDH引物上游：5’-ACA ACT TTG GTA TCG TGG AAG G-3’，下游：5’-GCC ATC ACG CCA CAG TTT C-3’；ENSG00000180712引物上游：5’-CCC AAA CCT GCC TTG ACT C-3’，下游：5’-CCA GAA CTT CGC CAC TAC CTA-3’；ENSG00000229649引物上游：5’-ATT TAG CGG GGA AAC AGT TCA C-3’，下游：5’-ACC ACA GGG CAG TTG ACA GA-3’；ENSG00000246089引物上游：5’-GGG AAT GAA AGA GAC TTC GGA T-3’，下游：5’-GGG ATT GCC TGA ATG TGA G-3’。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中差異表達(dá)的lncRNA

從Cancer LncRNome數(shù)據(jù)庫提取含有結(jié)直腸癌組織與正常結(jié)直腸組織芯片的數(shù)據(jù)，篩選差異表達(dá)的lncRNA。將得到的lncRNA與TCGA數(shù)據(jù)庫中l(wèi)ncRNA信息重合，篩選出在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中ID一致的lncRNA，共得到512條擴(kuò)增的lncRNA和1 901條降低的lncRNA。剔除PCG后，進(jìn)一步篩選出至少在30%的樣本里均表達(dá)的lncRNA，結(jié)果共納入52條擴(kuò)增的lncRNA和209條降低的lncRNA。以TCGA中l(wèi)ncRNA表達(dá)的中位數(shù)作為截?cái)嘀?，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，篩選出與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA，包括2條擴(kuò)增的lncRNA和12條降低的lncRNA(圖1A)，其中2條擴(kuò)增的lncRNA和6條降低的lncRNA與預(yù)后呈正相關(guān)(圖1B-1C)，并挑選ENSG00000180712、ENSG00000229649、ENSG0 0000246089和ENSG0000 0230850作為候選分子標(biāo)志物。

A：lncRNA的篩選過程；B-C：TCGA數(shù)據(jù)庫中l(wèi)ncRNA高表達(dá)和低表達(dá)患者的生存分析圖1 結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中差異表達(dá)的lncRNA

二、LncRNA在正常腸上皮細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)

經(jīng)LNCipedia(https://lncipedia.org/)數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證候選lncRNA的非編碼特性，發(fā)現(xiàn)僅LINC02363(ENSG00000180712)、lnc-LBX1-1∶1(ENSG00000 229649)和lnc-ANGPT2-2 (ENSG00000246089)為非編碼RNA。而ENSG00000230850暫不能證實(shí)其非編碼特性，故排除。

在正常腸上皮細(xì)胞和8種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中驗(yàn)證候選lncRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC02363和lnc-LBX1-1∶1在3種及以上結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)顯著低于正常腸上皮FHC細(xì)胞，而lnc-ANGPT2-2在3種結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)高于正常腸上皮細(xì)胞(圖2A-2C)。故本研究重點(diǎn)關(guān)注LINC02363和lnc-LBX1-1∶1。

三、LINC02363在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低

與FHC細(xì)胞相比，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.000 1圖2 lncRNA在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)(熒光定量PCR法)

進(jìn)一步行分析發(fā)現(xiàn)，53例結(jié)直腸癌組織中LINC02363表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.000 1)(圖3A)，而兩組lnc-LBX1-1∶1表達(dá)相比無明顯差異(圖3C)。TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中LINC02363表達(dá)顯著低于正常腸黏膜組織(P=0.027 1；圖3B)，而兩組lnc-LBX1-1∶1表達(dá)無明顯差異(圖3D)。故本研究選擇LINC02363作為潛在的結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物行下一步研究。

****P<0.0001A：53例患者中LINC02363表達(dá)；B：TCGA數(shù)據(jù)庫中LINC02363表達(dá)；C：53例患者中l(wèi)nc-LBX1-1∶1表達(dá)；D：TCGA數(shù)據(jù)庫中l(wèi)nc-LBX1-1∶1表達(dá)圖3 LINC02363在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低

四、結(jié)直腸癌組織LINC02363表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系

將TCGA數(shù)據(jù)庫中634例結(jié)直腸癌患者根據(jù)LINC02363表達(dá)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。Kaplan-Meier生存分析顯示LINC02363低表達(dá)組的生存期顯著短于LINC02363高表達(dá)組(P=0.025；圖1C)。LINC02363低表達(dá)與女性患者(P=0.017)、結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.015)相關(guān)，而與患者的初診年齡、臨床分期、結(jié)腸息肉病史等無關(guān)(表1)。說明低表達(dá)LINC02363的結(jié)直腸癌患者多為女性，后期預(yù)后較差且易發(fā)生癌組織遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

表1 結(jié)直腸癌患者LINC02363表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

討 論

發(fā)現(xiàn)非編碼RNA之前，癌癥驅(qū)動(dòng)因素的研究主要聚焦于PCG；但僅2%的人類基因組為PGC[13]。非編碼RNA曾被認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄噪聲”，近年發(fā)現(xiàn)其在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[14]。LncRNA是轉(zhuǎn)錄本長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA[15]。lncRNA表達(dá)具有較高的腫瘤特異性，差異表達(dá)的lncRNA可作為新型腫瘤標(biāo)志物[16-17]。在胃癌組織中高表達(dá)的lncRNA GClnc1通過調(diào)控組蛋白修飾促進(jìn)胃癌發(fā)生[18]；MALAT1是一種預(yù)測肺癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志物，可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)[19]。由于lncRNA定量檢測方法敏感、快速、成本低，且lncRNA往往形成相對穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，易在尿液和血液中檢測到[12]，因此，在癌癥預(yù)警、早期診斷、治療和分級(jí)方面，lncRNA可能是較為理想的、具有潛在應(yīng)用價(jià)值的生物學(xué)標(biāo)志物。

結(jié)直腸癌發(fā)病率高，易復(fù)發(fā)，病死率高，同時(shí)致病機(jī)制仍未完全闡明。近年研究結(jié)果表明，lncRNA表達(dá)異常與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[20-22]。CCAT1和CCAT2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高，高表達(dá)CCAT1和CCAT2者的無復(fù)發(fā)生存率和總生存率均較低[23]；HOTAIR在Ⅳ期結(jié)直腸癌患者癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，且HOTAIR表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移相關(guān)[24]；HULC在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中表達(dá)升高，而在原發(fā)灶中的表達(dá)與正常組織無明顯差異[25]；TUSC7在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低，通過競爭性結(jié)合miR-211，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[26]。Yan等[12]對TCGA數(shù)據(jù)庫中13種腫瘤的lncRNA表達(dá)改變進(jìn)行多平臺(tái)整合分析后，構(gòu)建了Cancer LncRNome數(shù)據(jù)庫，為癌癥分子標(biāo)志物的篩選提供了一個(gè)相對較短的候選lncRNA名單。本研究提取了Cancer LncRNome數(shù)據(jù)庫中與正常腸黏膜、結(jié)直腸癌組織相關(guān)的芯片數(shù)據(jù)，篩選出在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的lncRNA。隨后將篩選出的lncRNA與TCGA數(shù)據(jù)庫中有關(guān)的lncRNA重合，同時(shí)驗(yàn)證這些lncRNA對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響，篩選出在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)與預(yù)后呈正相關(guān)的lncRNA。進(jìn)一步通過文獻(xiàn)篩選和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低的LINC02363具有非編碼特性；且LINC02363在多種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中較正常腸上皮細(xì)胞表達(dá)減少。同時(shí)，在納入的53例結(jié)直腸癌患者隊(duì)列和TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌患者隊(duì)列中，LINC02363表達(dá)顯著降低。提示LINC02363表達(dá)下調(diào)可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

進(jìn)一步分析TCGA數(shù)據(jù)庫中的634例結(jié)直腸癌患者后發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)LINC02363的患者多為女性，Kaplan-Meier生存分析顯示LINC02363低表達(dá)組的生存期顯著短于高表達(dá)組，且LINC02363低表達(dá)與結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。提示LINC02363可預(yù)測結(jié)直腸癌患者的預(yù)后和腫瘤轉(zhuǎn)移情況，低表達(dá)LINC02363的結(jié)直腸癌患者預(yù)后差、轉(zhuǎn)移可能性大，應(yīng)在早期給予積極治療，同時(shí)切除病灶后進(jìn)行密切隨訪。

綜上所述，LINC02363在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后相關(guān)，提示LINC02363有可能作為臨床評估結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的候選基因。