謝 穎，周仲實(shí)，劉艷菊，2，肖錕鈺，雷 林

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥炮制教研室，湖北 武漢 430065；2.湖北省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430065)

蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)或北蒼術(shù)的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。蒼術(shù)味辛、苦、溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒和明目的功效[2]。蒼術(shù)具有較強(qiáng)的燥性，生品燥性強(qiáng)烈多用于濕證的治療，炮制后燥性得到緩和，健脾作用增強(qiáng)[3]。古人對蒼術(shù)的燥性早有認(rèn)知，并運(yùn)用多種不同的方法進(jìn)行炮制，以緩和其燥性[4]，主要用于濕阻中焦等證。目前國內(nèi)外多采用濕阻中焦證和脾虛泄瀉證等模型研究蒼術(shù)對動(dòng)物胃腸動(dòng)力的影響，以探尋其燥濕健脾的物質(zhì)基礎(chǔ)及其機(jī)制[5-7]。蒼術(shù)之燥性是其藥性的重要表現(xiàn)，既可發(fā)揮藥效作用，又能引起不良反應(yīng)[8]。本課題組前期對蒼術(shù)的燥性化學(xué)部位及其效應(yīng)進(jìn)行了相關(guān)研究，但關(guān)于蒼術(shù)劑量與燥性表現(xiàn)的量-效關(guān)系未進(jìn)行系統(tǒng)分析。

干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)/SCF受體c-kit信號(hào)途徑在腸道運(yùn)動(dòng)方面發(fā)揮重要的作用[9]。研究[10-11]顯示：慢傳輸性便秘的發(fā)生發(fā)展與SCF和c-kit表達(dá)降低有關(guān)；祝婧等[12]在研究枳殼燥性時(shí)發(fā)現(xiàn)：長期使用枳殼生品會(huì)抑制結(jié)腸SCF和c-kit基因的表達(dá)。由此推斷，SCF/c-kit信號(hào)途徑影響便秘的發(fā)生，同時(shí)與燥性相關(guān)。本課題組在前期研究蒼術(shù)燥性的基礎(chǔ)上，除選擇常用效應(yīng)指標(biāo)外，增加便秘相關(guān)基因SCF和c-kit的表達(dá)作為考察指標(biāo)，系統(tǒng)研究不同劑量蒼術(shù)揮發(fā)油對小鼠燥性效應(yīng)的影響，為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試藥、主要試劑和儀器SPF級C57BL/6小鼠，雄性，6～7周齡，體質(zhì)量18～20 g，由湖北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0012。

取蒼術(shù)飲片，打粉，稱取蒼術(shù)粗粉500 g置于5 000 mL的圓底燒瓶中，加入4 000 mL蒸餾水，于電熱套中恒溫加熱回流提取，至油量不再增加，棄去前3滴油，石油醚萃取，靜置過夜，萃取后至蒸發(fā)皿中于通風(fēng)櫥內(nèi)揮去石油醚，得蒼術(shù)揮發(fā)油，避光密封保存于-20℃冰箱備用。精密稱取蒼術(shù)揮發(fā)油于容量瓶中，加入1%吐溫-80溶液，定容，混勻。配成12.33 g·L-1的185 mg·kg-1劑量組試藥劑量，同法配置成24.66 g·L-1的370 mg·kg-1劑量組試藥劑量、36.99 g·L-1的555 mg·kg-1劑量組試藥劑量和49.32 g·L-1的740 mg·kg-1劑量組試藥劑量。

石油醚、吐溫-80、氯仿、異丙醇和無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，TRIzol和焦碳酸二乙酯(DEPC)(美國Amresco公司 )，水通道蛋白2(aquaporin 2,AQP2)抗體(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)，蘇木素和伊紅(HE)染色液(北京索萊寶科技有限公司)，山羊抗兔IgG二抗[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]。切片機(jī)(浙江省永康市兆申電器有限公司)，烘箱和打粉機(jī)(廣州康恒儀器有限公司)，包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，正置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，熒光定量PCR儀(德國JENA公司)，離心機(jī)(韓國Gene公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理75只小鼠隨機(jī)分為對照組和185、370、555及740 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組，每組15只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對照組小鼠給予0.015 mL·g-1的1%吐溫-80溶液灌胃，其余各組小鼠按對應(yīng)劑量給予0.015 mL·g-1蒼術(shù)揮發(fā)油灌胃，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥 14 d。

1.3 小鼠日均飲水量和日均尿量測定以每組每只小鼠的每周飲水的平均量計(jì)算，每日定時(shí)添加與測量飲水量，前1 d的水質(zhì)量M1與當(dāng)天所剩的水質(zhì)量M2的差值為該組小鼠的當(dāng)日飲水總量，除以各組小鼠的只數(shù)，即為每只小鼠每日平均飲水量。小鼠給藥1周后，使用小鼠代謝籠收集小鼠每日12 h尿液，收集期間禁水，記錄每日尿量，連續(xù)1周，計(jì)算各組小鼠每日平均尿量，除以小鼠個(gè)數(shù)，即為該組每只小鼠日平均尿量。因收集尿液同時(shí)小鼠禁食禁水，為避免小鼠在此過程中死亡，遂將每組老鼠分為5只一小組，每日選取10只，交替收集尿液。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測小鼠腎組織中AQP2蛋白表達(dá)水平小鼠處死后，迅速取出腎臟，解剖刀矢狀面切開，將組織置于4%多聚甲醛固定液中固定、包埋、切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測。每張切片隨機(jī)選3個(gè)200倍視野，采用 Image-Pro Plus 6.0 軟件分析小鼠腎臟內(nèi)棕黃色區(qū)域的平均光密度(AOD)值，以AOD值代表AQP2蛋白表達(dá)水平。

1.5 計(jì)算小鼠脾臟系數(shù)和腎臟系數(shù)稱小鼠體質(zhì)量，處死后剖腹，小心摘取脾臟和腎臟，稱質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)。

1.6 RT-PCR法檢測小鼠結(jié)腸組織中SCF和c-kit mRNA表達(dá)水平取各組小鼠結(jié)腸組織樣本于勻漿器中，加入TRIzol試劑提取總RNA，測定其濃度與純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃、1 min；95℃、20 s，60℃、45 s，循環(huán)40次。從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)獲取目的基因mRNA的全長序列，采用Primer-BLAST軟件設(shè)計(jì)引物序列，由北京擎科生物科技有限公司合成。相關(guān)引物序列：SCF，F(xiàn) 5′-GAATCTCCGAAGAGGCCAGAA-3′，R 5′-GCTGCAACAGGGGGTAACAT-3′；c-kit，F(xiàn) 5′-CAGTGTGTGGCAGAGGGATT-3′，R 5′-TGGGCCTGGATTTGCTCTTT-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算結(jié)腸組織中SCF和c-kit mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠行為學(xué)觀察灌胃給藥2周后，與對照組比較，740 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠飲食量降低，體質(zhì)量增長緩慢，自發(fā)活動(dòng)減少，出現(xiàn)嗜睡、喜臥、四肢發(fā)軟、毛發(fā)毛糙無光澤和大便干結(jié)等表現(xiàn)，其他劑量蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠無明顯異常。

2.2 各組小鼠日均飲水量和日均尿量與對照組比較，185、370和555 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠日均飲水量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)， 740 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠日均飲水量明顯增加(P<0.01)。與對照組比較，185和370 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠日均尿量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，555 和740 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠日均尿量明顯降低(P<0.01)。見表1。

2.3 各組小鼠腎組織中AQP2蛋白表達(dá)水平與對照組比較，185、370和555 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠腎組織中AQP2蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，740 mg·kg-1組小鼠腎組織中AQP2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。見圖1(插頁三)和表2。

2.4 各組小鼠腎臟系數(shù)和脾臟系數(shù)與對照組比較，各劑量蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠腎臟系數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，185和370 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠脾臟系數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，555和740 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠脾臟系數(shù)明顯降低(P<0.01)。見表3。

表1 各組小鼠日均飲水量和日均尿量

表2 各組小鼠腎組織中AQP2蛋白表達(dá)水平

表3 各組小鼠腎臟系數(shù)和脾臟系數(shù)

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織中SCF和c-kit mRNA表達(dá)水平與對照組比較，185 和370 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠結(jié)腸組織中SCF mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，555 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠結(jié)腸組織中SCF mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，740 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠結(jié)腸組織中SCF mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與對照組比較，185 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠結(jié)腸組織中c-kit mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，370 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠結(jié)腸組織中c-kit mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，555 和740 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠結(jié)腸組織中c-kit mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠結(jié)腸組織中SCF和c-kit mRNA表達(dá)水平

3 討 論

中藥的燥性不僅包括治療作用，同時(shí)也包括不良反應(yīng)[13]。中醫(yī)辯證用藥，根據(jù)病癥不同，用藥劑量有所不同。《中華人民共和國藥典一部》[2]規(guī)定蒼術(shù)劑量為3～9 g，而古代醫(yī)家用蒼術(shù)治療脾胃濕證時(shí)，組方所用蒼術(shù)劑量遠(yuǎn)超藥典劑量。如清代劉完素的《素問病機(jī)氣宜保命集》中蒼術(shù)湯所用到的蒼術(shù)劑量為4兩(約149.2 g)，金代李杲的《脾胃論》升陽除濕防風(fēng)湯中蒼術(shù)用藥劑量同樣為4兩(約149.2 g)。上述經(jīng)方主治脾胃濕證，其蒼術(shù)用量是常規(guī)用量的15倍，也高出本實(shí)驗(yàn)燥性基礎(chǔ)劑量，但安全有效，未表現(xiàn)出明顯不良反應(yīng)。其原因可能是大劑量使用蒼術(shù)用于治療脾胃濕證，正是治病之所需，未見燥性表現(xiàn)，可能與中醫(yī)的“有故無殞，亦無殞也”理論有關(guān)。因此在病理情況下，用高劑量蒼術(shù)仍以發(fā)揮藥效為主。本研究以健康小鼠為研究對象，考慮健康小鼠在正常生理狀態(tài)下對藥物反應(yīng)更敏感，便于觀察。

基于本課題組前期對蒼術(shù)燥性效應(yīng)研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠日均飲水量、日均尿量、腎組織中AQP2蛋白表達(dá)水平和臟器系數(shù)等常用燥性效應(yīng)指標(biāo)。水通道蛋白 (aquaporins, AQPs) 是一種與水分子進(jìn)出細(xì)胞膜相關(guān)的膜鑲嵌蛋白，其中AQP2主要分布在腎集合管上皮細(xì)胞，在水分子重吸收, 尿液形成過程中起重要作用[14]。 研究[15]顯示：腎組織中AQP2表達(dá)水平降低可引起尿液增加，腎組織中AQP2表達(dá)水平升高則尿液減少，AQP2對維持機(jī)體水平衡、調(diào)節(jié)體液容量和滲透壓十分重要。文獻(xiàn)[16]報(bào)道：津液不足或外燥侵襲的津液虛證使臟腑組織失去濡養(yǎng)，表現(xiàn)為耳、鼻、咽、喉、皮膚和大便等干燥，眼球深凹，口渴，小便短少，脈細(xì)數(shù)等津液虧虛癥候。本研究結(jié)果顯示：高劑量蒼術(shù)揮發(fā)油可使小鼠產(chǎn)生口干、口渴、少尿和大便干結(jié)等，符合津液虧虛證特點(diǎn)，推測高劑量蒼術(shù)揮發(fā)油可能導(dǎo)致小鼠機(jī)體津液的虧損。

c-kit屬于酪氨酸激酶受體家族一員，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化[17]。SCF是c-kit的天然配體，SCF在全身多種組織細(xì)胞中均有表達(dá)，主要是由骨髓中的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，在胃腸道中，平滑肌細(xì)胞也能產(chǎn)生SCF[18]。Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of cajal, ICC)是胃腸道的起搏細(xì)胞，已被普遍認(rèn)為在胃腸道動(dòng)力障礙性疾病中具有重要作用[19]。近年來研究[9]顯示：ICC的特異受體c-kit及其配體SCF構(gòu)成的信號(hào)途徑對ICC的發(fā)生、發(fā)育及功能維持具有重要的調(diào)控作用；便秘的發(fā)生與胃腸道ICC分布和功能異常有密切關(guān)聯(lián)，便秘患者或動(dòng)物的結(jié)腸中SCF和C-kit基因表達(dá)較正常者降低[10]。SCF/c-kit系統(tǒng)受損后，會(huì)使腸道運(yùn)輸能力減弱[11]，而腹瀉動(dòng)物模型中SCF和c-kit基因表達(dá)升高[20]。

本研究以健康C57BL/6[2]小鼠為研究對象，以《中華人民共和國藥典一部》規(guī)定蒼術(shù)最大用量的2、4、6和8倍所得揮發(fā)油梯度(185、370、555和740 mg·kg-1)給藥，結(jié)果顯示：185和370 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油對健康小鼠未表現(xiàn)出燥性作用，555 mg·kg-1以上劑量蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠出現(xiàn)燥性表現(xiàn)，740 mg·kg-1蒼術(shù)揮發(fā)油組小鼠燥性表現(xiàn)明顯，提示給予健康小鼠8倍劑量蒼術(shù)揮發(fā)油可產(chǎn)生明顯燥性。

綜上所述，高劑量的蒼術(shù)揮發(fā)油可能通過影響SCF/c-kit信號(hào)通路，從而影響了ICC的發(fā)生和發(fā)育，導(dǎo)致胃腸道功能紊亂，進(jìn)而引起小鼠大便的干結(jié)或便秘，與蒼術(shù)臨床用藥表征相印證。