謝雯琴，唐 偉，胡 丹，楊凌宸*，劉 偉*

（1. 永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 永州 425100；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

裂頭蚴（Sparganum）為歐洲刺猬迭宮絳蟲(chóng)（Spirometra erinaceieuropaei）或曼氏迭宮絳蟲(chóng)（Spirometra mansoni）中絳期幼蟲(chóng)的同種異名，是一種重要的人畜共患寄生蟲(chóng)[1]。裂頭蚴寄生于蛇、蛙等中間宿主皮下、肌肉等部位，同時(shí)在人的眼、皮下、內(nèi)臟和生殖系統(tǒng)等部位也可寄生[2-3]。終末宿主（如犬、狐貍）吞食感染裂頭蚴的中間宿主（如蛙、蛇等）后，裂頭蚴可寄生于終末宿主小腸，繼而發(fā)育為猬迭宮絳蟲(chóng)。裂頭蚴病在全世界分布較為廣泛，不僅給相關(guān)養(yǎng)殖業(yè)造成一定經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)對(duì)人類(lèi)公共健康造成重大威脅。

寄生蟲(chóng)學(xué)研究的前提與基礎(chǔ)是對(duì)寄生蟲(chóng)進(jìn)行準(zhǔn)確的分類(lèi)鑒定，而寄生蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定在生物種群的不斷進(jìn)化和發(fā)展的前提下顯示出了其局限性，從形態(tài)上難以對(duì)相似種或近緣種進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，而分子分類(lèi)學(xué)方法（如PCR 技術(shù)）可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒定方法的缺陷[4-6]。本研究利用PCR 技術(shù)對(duì)湖南省不同地區(qū)蛇源裂頭蚴線粒體cox3 基因部分序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，并通過(guò)對(duì)序列的分析初步明確蛇源裂頭蚴遺傳變異情況及其與其它絳蟲(chóng)的遺傳進(jìn)化關(guān)系，為蛇源裂頭蚴的分子流行病學(xué)和群體遺傳研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 裂頭蚴樣品來(lái)源本研究的8 株裂頭蚴樣品分離自野生大王蛇，采集自湖南耒陽(yáng)（LY）、湘潭（XT）、長(zhǎng)沙（CS）、益陽(yáng)（YiY）、湘鄉(xiāng)（XX）、岳陽(yáng)（YuY）、株洲（ZZ）、邵陽(yáng)（SY）共8 個(gè)地區(qū)。按照常規(guī)操作從皮下或肌肉中采集裂頭蚴，根據(jù)蟲(chóng)株形態(tài)學(xué)特征鑒定為猬迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴[7]，用生理鹽水將蟲(chóng)株沖洗、編號(hào)，70%酒精保存于-20 ℃。

1.2 主要試劑組織DNA 提取試劑盒等耗材購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker、PCR 試劑均購(gòu)自TaKaRa 公司；蛋白酶K 購(gòu)自Merck公司；引物由湖南擎科生物有限公司合成。

1.3cox3基因的PCR 擴(kuò)增從70%的酒精保存液中取出單個(gè)蟲(chóng)體，用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗2 次后，再用純凈水反復(fù)沖洗2～3 次，置于一新的離心管中，在純凈水中浸泡20 min，吸干水分。利用基因組DNA 提取試劑盒分別提取8 株裂頭蚴的基因組，采用文獻(xiàn)[8]中cox3基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引 物Secox3-F： 5'-TGCATTTTGGTTATTCTTAG-3'/下游引物Secox3-R：5'-ACGATAGGCCCCGGCTGAA G-3'。PCR 擴(kuò) 增 條 件 為：94 ℃5 min；94 ℃30 s、50 ℃30 s、72 ℃1 min，共36 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。PCR產(chǎn)物回收純化后由上海華大基因有限公司測(cè)序。

1.4cox3基因的序列分析利用DNAstar 5.0 軟件對(duì)cox3 基因進(jìn)行序列分析，并與GenBank 中同種裂頭蚴和其它種絳蟲(chóng)cox3 基因序列進(jìn)行種內(nèi)及種間比對(duì)。利用Megan 5.0 軟件采用NJ 法（Neighbor-Joining，鄰接法）繪制cox3 基因的種系進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離蟲(chóng)株樣品PCR 擴(kuò)增結(jié)果對(duì)湖南省8 株裂頭蚴均擴(kuò)增出約350 bp 的cox3 基因部分序列，與預(yù)期目的片段長(zhǎng)度相符（圖1），表明正確擴(kuò)增了裂頭蚴的cox3 基因。

近幾年來(lái)，PCR 技術(shù)在寄生蟲(chóng)分子分類(lèi)學(xué)和分子遺傳學(xué)等方面的研究應(yīng)用廣泛[9-12]，其中線粒體cox3 基因序列被廣泛用于研究多種寄生蟲(chóng)包括蛔蟲(chóng)、猬迭宮絳蟲(chóng)等種內(nèi)和種間遺傳變異的分析[10-12]。

2.2 分離株cox3基因測(cè)序與序列分析結(jié)果測(cè)序結(jié)果顯示湖南部分地區(qū)8 個(gè)分離株cox3 基因部分序列大小一致，均為342 bp，A+T 堿基含量（65.13%～66.37%）明顯高于C+G 堿基含量（33.63%～34.87%）。核苷酸同源性分析結(jié)果顯示，8 個(gè)分離株cox3 基因序列之間的同源性為98.2%～100.0%，種內(nèi)差異性為0～1.8%，其差異主要是以堿基互換為主；與GenBank登錄的蛙源猬迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴同源性為98.9%～99.4%，與蛇源猬迭宮絳蟲(chóng)裂頭蚴同源性為97.6%～98.2%，與其它科絳蟲(chóng)的同源性為63.4%～73.9%，種間差異為26.1%～36.6%。結(jié)果表明蛇源裂頭蚴cox3基因序列種內(nèi)差異較種間差異小。

本研究采用PCR 技術(shù)，首次對(duì)湖南省部分地區(qū)蛇源裂頭蚴線粒體cox3 基因部分序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序并對(duì)序列進(jìn)行分析，初步明確湖南省部分蛇源裂頭蚴遺傳變異情況及其與其它絳蟲(chóng)遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2.3cox3基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建和分析利用Mega5.0 軟件中的NJ 法構(gòu)建基于線粒體cox3 基因序列的種系發(fā)育樹(shù)，分析蛇源裂頭蚴與其它絳蟲(chóng)的遺傳進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果顯示，8 株分離的裂頭蚴，與GenBank 登錄的不同宿主的猬迭宮絳蟲(chóng)位于同一分支，但與其它絳蟲(chóng)如裂頭絳蟲(chóng)（Diphyllobothrium nihonkaiense，EF420138.1）、犬復(fù)孔絳蟲(chóng)（Dipylidium caninum，AB732959.1）、犬復(fù)殖孔絳蟲(chóng)（Diplogonoporus grandis，AB425840.1）、細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（Echinococcus granulosus，MK774655.1）和帶狀絳蟲(chóng)（Taenia solium，AF367053.1） 所屬分支相隔較遠(yuǎn)（圖2）。結(jié)果表明，cox3 序列種間差異較大，種內(nèi)相對(duì)保守。

圖2 基于線粒體cox3 基因構(gòu)建的蛇源裂頭蚴系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic analysis of cox3 gene sequences from the snake Sparganum

本研究結(jié)果表明線粒體cox3 基因可以用于研究蛇源裂頭蚴種系遺傳變異的分子標(biāo)記，為蛇源裂頭蚴的分子流行病學(xué)和群體遺傳研究奠定基礎(chǔ)。