張國建，韋麗虹，肖云峰，王文睿，王雪梅，魯海文

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院藥學部，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學新藥安全評價研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院影像教研室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

隨著心血管病患病人數(shù)不斷攀升，如何通過有效手段降低心血管病發(fā)病率與死亡率已成為重大公共衛(wèi)生問題[1]。心肌組織缺血后可得到再灌注[2]，可能加重功能障礙及結(jié)構(gòu)損傷[3]，即心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)。藥物預適應(yīng)是保護受損心肌的常用方法之一。廣棗-7味丸治療冠心病、心絞痛，抗心律失常及保護心肌等方面效果已獲肯定[4-5]，但對其作用機制尚未完全明了。本研究以Micro PET/CT分子顯像觀察廣棗-7味丸抗MIRI作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級雄性SD大鼠120只(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學動物實驗中心)，體質(zhì)量(400±50)g，隨機均分為6組，每組20只。①低、中、高劑量組：將廣棗-7味丸研磨成粉末混懸于CMC-Na，連續(xù)灌胃14天,劑量分別為150 mg/(kg·d)、300 mg/(kg·d)、600 mg/(kg·d)，灌胃結(jié)束后2 h造模。②空白對照組：0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose, CMC-Na)連續(xù)灌胃14天，劑量為5 ml/(kg·d)。③模型對照組：結(jié)扎冠狀動脈左前降支60 s，恢復血流再灌注，0.5% CMC-Na連續(xù)灌胃14天，5 ml/(kg·d)。④陽性對照組：復方丹參滴丸粉末混懸于CMC-Na，連續(xù)灌胃14天，300 mg/(kg·d)，結(jié)束后2 h造模。

1.2 MIRI模型制備 腹腔注射10%水合氯醛(10 ml/100 g體質(zhì)量)麻醉，仰臥位保定，固定四肢，行氣管插管，連接小動物呼吸機(潮氣量20 ml/kg體質(zhì)量，呼吸比1∶2，頻率40次/分)。胸部備皮，于左鎖骨中線與左側(cè)第3～5肋間開胸，充分暴露心臟，以5-0號結(jié)扎線活結(jié)扎冠狀動脈左前降支60 s，以心電圖T波改變、心肌顏色由紅變?yōu)闇\紅色為心肌缺血造模成功。松解結(jié)扎線使血流再通，迅速將心臟送回胸腔,清除胸腔內(nèi)血液，排除空氣并關(guān)閉胸腔逐層縫合。去呼吸機，使動物恢復自主呼吸。于造模前后各時段描記心電圖。

1.3 Micro PET/CT心肌顯像 采用Siemens Innovation Drive MM小動物PET/CT掃描儀，以GE MINItrace回旋加速器合成13N-ammonia顯像劑，放射化學純度>98%。將模型鼠置于恒溫麻醉艙中，以2.5%異氟烷混合氣體(體積比，異氟烷：氧氣)麻醉成功后俯臥位保定于Micro PET/CT檢查床，以3.5%異氟烷混合氣體持續(xù)麻醉。經(jīng)鼠尾靜脈注射13N-ammonia2 mCi后首先采集CT圖像，電壓80 kV，電流500 μA，掃描層厚0.06 mm；5 min后采集PET圖像，采集時間10 min，視野12.7 cm。

1.4 數(shù)據(jù)處理及圖像判讀 于Siemens Inveon MM工作站分別獲得CT和PET及融合圖像，由2名高年資核醫(yī)學醫(yī)師盲法獨立閱片，利用IRW圖像融合軟件進行圖像判讀及計算、分析，意見不一時經(jīng)討論決定。心肌缺血部位最大層面及上下2個較小層面勾畫ROI，軟件自動得出心肌缺損感興趣容積(volume of interest， VOI)。計算建模后心肌平均標準攝取值(mean standardized uptake value, SUVmean)。

1.5 血清學指標 自頸總動脈取MIRI大鼠血5 ml，加入肝素，1 500 r/min離心10 min后取血清，以全自動生化分析儀測定血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)和肌酸激酶(creatine kinase, CK)。

1.6 病理觀察 顯像完成后處死模型鼠，取出心臟，用固定液沖洗，將左心室前壁心肌組織切成條狀，放在固定液中2 h，再用0.09 mmol KH2PO4漂洗15 min并保存。常規(guī)乙醇逐級脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋，間斷均勻切片，HE染色，于光鏡下觀察心肌病理結(jié)構(gòu)改變。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。以±s表示滿足正態(tài)分布和方差齊性的計量資料，中位數(shù)(上下四分位數(shù))表示不滿足正態(tài)分布或方差齊性的計量資料。組間及組內(nèi)采用方差分析，配對設(shè)計資料采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MIRI模型建立 對100只大鼠行冠狀動脈左前降支前下1/3阻斷60 s，9只死于建模過程中，4只死于麻醉意外，5只死于顯像過程中，見表1。建模后心電圖Ⅱ?qū)?lián)T波改變ST段壓低>0.2 mV提示建模成功，其組織病理學改變見圖1、2。

圖1 心肌大體解剖 A.正常心肌； B.MIRI模型大鼠心尖局部心肌組織顏色變淺(紅圈) 圖2 心肌組織病理學(HE，×400) A.正常心??； B.MIRI模型大鼠心肌

表1 各組各時間點心肌缺血體積比較(cm3，±s)

表1 各組各時間點心肌缺血體積比較(cm3，±s)

組別24 h48 h72 hF值P值低劑量組(n=15)6.33±2.023.31±1.331.26±0.6846.520.001中劑量組(n=17)6.01±1.562.61±1.01-110.71<0.001高劑量組(n=17)3.32±0.861.32±0.58-116.72<0.001空白對照組(n=19)-----模型對照組(n=18)7.13±2.427.02±1.846.98±2.180.0410.960陽性對照組(n=16)4.12±0.692.38±0.90-150.33<0.001F值15.7553.19187.66--P值<0.001<0.001<0.001-- 注:24 h高劑量組與陽性對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),余組間差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05);48 h模型對照組與其他組間差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05),高劑量組與陽性對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),高劑量組與中、低劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05);72 h模型對照組與其他組間差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)

2.2 心肌缺血體積及SUVmean變化 各組各時間點心肌缺血體積見表1、圖3。各劑量組受損心肌體積均減小，以高劑量組效果最好；各劑量組各時間點心肌缺血部位SUVmean見表2，缺血部位SUVmean隨時間延長逐漸增高，提示血流逐漸恢復。

圖3 各組各時間點心肌血流灌注圖像(垂直長軸) 左心室心尖部顯像劑稀疏區(qū)面積(箭)在模型對照組隨時間無明顯變化，低劑量組隨時間推移逐漸減小，中劑量組隨時間推移逐漸減小至消失，高劑量組隨時間推移逐漸減小至消失

表2 各時間點心肌缺血部位SUVmean(±s)

表2 各時間點心肌缺血部位SUVmean(±s)

組別24 h48 h72 hF值P值低劑量組(n=15)0.77±0.16*#1.22±0.52*#3.62±0.76*#121.82*#<0.001中劑量組(n=17)0.94±0.15*#2.11±0.50*#4.75±0.33*#450.82*#<0.001高劑量組(n=17)0.97±0.16*#2.45±0.44*#4.94±0.44*#435.75*#<0.001空白對照組(n=19)4.98±0.485.05±0.475.04±0.420.0950.910模型對照組(n=18)0.61±0.210.71±0.180.75±0.172.4080.102陽性對照組(n=16)0.95±0.14*#2.40±0.40*#4.81±0.35*#556.83*#<0.001F值560.22171.09205.17--P值<0.001<0.001<0.001--

注：*：與空白對照組比較P<0.05；#：與模型對照組比較P<0.05

2.3 血清學指標 各組血清氧化應(yīng)激指標SOD、MDA水平和心肌酶LDH、CK活性見表3。

表3 各組大鼠血清學指標(±s)

表3 各組大鼠血清學指標(±s)

組別LDH(U/L)CK(U/L)SOD(U/ml)MDA(nmol/g)低劑量組(n=15)691.73±162.27*#1 153.74±187.81*#462.82±37.14*#7.98±1.26*#中劑量組(n=17)649.92±171.25*#1 165.42±167.83*#491.38±24.19*#7.24±1.08**#高劑量組(n=17)671.38±168.69*#1 209.84±163.47*#511.83±23.86*#7.69±1.34*#空白對照組(n=19)609.54±142.411 091.45±195.141523.51±27.656.91±1.42模型對照組(n=18)721.51±138.531 259.37±207.17452.45±30.178.17±1.93陽性對照組(n=16)636.28±151.62*#1 157.42±148.43*#490.87±27.72*#7.38±1.26*#F值59.1774.8441.489.67P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：*：與空白對照組比較P<0.05；#：與模型對照組比較P<0.05

3 討論

目前研究蒙藥療效及藥效機制大多針對某種成分采用生物血清學測量分析、血清藥理學技術(shù)、制劑學或是離體心肌組織病理學方法[6-8]，但蒙藥所獲功效是各成分協(xié)同作用、聯(lián)合起效，以多靶點、多渠道、多層次完成整體調(diào)節(jié)而產(chǎn)生治病生物效應(yīng)的結(jié)果，重在調(diào)節(jié)機體功能、調(diào)和體素，恢復機體自愈能力，將各成分分割開來不利于理解其機制。本研究以分子影像學方法觀察蒙藥對于活體的作用，結(jié)果表明利用分子影像學方法可無創(chuàng)評價蒙藥活體作用機制。

MIRI可引起心臟功能障礙、生化代謝異常、心肌梗死面積擴大及心肌組織病理改變等，可能是繼發(fā)心力衰竭和心源性死亡的潛在重要原因之一。氧自由基主要包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(·OH)，幾乎可與細胞內(nèi)所有有機物反應(yīng)而破壞核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸和脂類化合物，損害細胞功能[4]。正常生理條件下細胞內(nèi)存在抗氧化物質(zhì)，可及時清除氧自由基，使其生成與降解處于動態(tài)平衡；心肌缺血/再灌注恢復血液及氧供應(yīng)時,氧自由基大量產(chǎn)生、急劇堆積及抗氧化酶類活性下降引發(fā)鏈式脂質(zhì)過氧化反應(yīng),損傷細胞膜、細胞器乃至細胞核酸,引發(fā)細胞內(nèi)鈣超載、造成心肌細胞急性或慢性損傷，導致細胞壞死凋亡。

蒙藥廣棗-7味丸由廣棗、沉香、肉豆蔻、木香、丁香、楓香脂和牛心粉七味藥材組成，可養(yǎng)心、益氣、安神，用于胸悶疼痛、心悸氣短、心神不安及失眠健忘[9]，多糖、黃酮類和酚類是其主要抗氧化活性成分[10-12]，能明顯降低小鼠耗氧量及耗氧速度，提高耐缺氧能力、擴張冠狀動脈、改善微循環(huán)、清除自由基，并提高心肌SOD活性[13]。

13N-ammonia PET顯像可早期評估受損心肌血流灌注狀態(tài)。朱君艷等[14]研究證實13N-ammonia PET可用于早期發(fā)現(xiàn)放射性心臟損傷，并監(jiān)測心臟損傷動態(tài)發(fā)展。本研究表明13N-ammonia PET心肌灌注顯像能夠評價廣棗-7味丸活體抗MIRI作用，各劑量組對MIRI均具有保護作用，以中、高劑量組效果好，并均能保護受損心肌，以高劑量組效果最好。

LDH和CK水平被認為是心肌損傷的標志酶。SOD為自由基清除劑，廣泛存在于生物體各種組織中，能清除超氧陰離子自由基。MDA含量是過氧化反應(yīng)的指標，可間接揭示活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成水平。本研究證實，各劑量廣棗-7味丸均可清除體內(nèi)自由基而保護缺血-再灌注損傷心肌，高劑量組對SOD作用效果最好，中劑量組對于MDA、LDH作用效果最好，而低劑量組對CK作用效果最好。

氧化應(yīng)激是導致細胞凋亡的重要原因之一[15]。HARMAN[16]提出自由基理論，認為衰老由2種機制導致，一是過氧化物作用致使細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，二是線粒體呼吸作用而致衰老。隨著年齡增長，機體內(nèi)MDA含量逐漸升高，SOD含量逐漸降低[17-18],氧化應(yīng)激通過調(diào)控凋亡基因相關(guān)通路誘導細胞凋亡[19-20]。

綜上，廣棗-7味丸通過清除體內(nèi)自由基、減輕氧化應(yīng)激損傷、影響相關(guān)酶活性等方式發(fā)揮抗MIRI作用。Micro PET/CT分子顯像能無創(chuàng)動態(tài)檢測活體MIRI，準確評估廣棗-7味丸對鼠MIRI的保護作用；各劑量廣棗-7味丸均對MIRI具有保護作用，高劑量效果更好。