白明煥，耿 毅，趙若璇，郭向輝，黃小麗，陳德芳，歐陽萍，汪 蕉

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，四川 成都 611130)

海豚鏈球菌Streptococcus iniae作為一種重要的魚類病原菌，其感染常致高發(fā)病率和病死率。自1972年首次從亞馬遜淡水海豚Inia geoffrensis中分離得到以來，S.iniae先后在美國[1]、日本[2]、以色列[3]等地被報(bào)道，對(duì)全球的溫水魚養(yǎng)殖造成了巨大的影響并持續(xù)至今[4-8]。各國相繼開展對(duì)海豚鏈球菌的相關(guān)研究，目前海豚鏈球菌至少存在2種生物型，且各型菌株的致病性有所差異[9-10]，同時(shí)海豚鏈球菌還有scpI、simA、cpsD、sagA、pdi、pgm和cfi等多種毒力因子[11-14]，各毒力因子之間的相互作用也是導(dǎo)致其致病性差異的重要原因，因此開展對(duì)海豚鏈球菌毒力譜及分型的研究對(duì)海豚鏈球菌病的防控，尤其是疫苗的研制具有重要的意義。

四川作為一個(gè)鱘科Acipenseridae養(yǎng)殖大省，在鱘魚養(yǎng)殖過程中海豚鏈球菌病的危害較為嚴(yán)重[15-16]，盡管對(duì)部分菌株進(jìn)行了毒力基因譜與分型的研究，但對(duì)于四川地區(qū)各流行菌株的基因型、主要流行基因型、毒力基因譜，及是否發(fā)生變異等都不清楚。本研究采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)、重復(fù)序列 PCR(Repetitive element polymerase chain reaction，REPPCR)和多重PCR對(duì)17株鱘源海豚鏈球菌進(jìn)行毒力基因譜與分子分型研究，以探明四川鱘源海豚鏈球菌分子流行病學(xué)特點(diǎn)，為有針對(duì)地篩選四川鱘海豚鏈球菌病疫苗候選株及防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

BHI培養(yǎng)基購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；PCR master mix、DL2000 DNA marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自天根生化科技 (北京)有限公司；API STREP 20 鑒定系統(tǒng)購自法國生物梅里埃公司；海豚鏈球菌ATCC29178株，購自ATCC菌種中心。

1.2 病原菌的分離和純化

2016—2018 年從四川雅安、彭州、邛崍、蒲江等地送檢的發(fā)病鱘魚，首先用生理鹽水沖洗體表，并用含體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液的棉球進(jìn)行體表消毒，然后用無菌的剪刀打開腹腔，分別從肝、脾、腎接菌至BHI培養(yǎng)基，并放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)18～24 h，挑取BHI平板上菌落形態(tài)、大小一致的可疑菌落劃線接種于BHI平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，挑取單菌落進(jìn)行后續(xù)鑒定。獲得純化后的菌株4 ℃保存?zhèn)溆谩９卜蛛x得到17株海豚鏈球菌。

1.3 病原菌的形態(tài)觀察及l(fā)ctO基因的特異性鑒定

取對(duì)數(shù)生長期的新鮮菌液觀察其菌體形態(tài)，并按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。根據(jù)Mata等[17]的方法，設(shè)計(jì)合成S.iniae lctO基因的一對(duì)特異性擴(kuò)增引物(表1)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[15]。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，10 g/L的瓊脂糖凝膠，在恒壓125 V下電泳35 min，置于凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果并拍照記錄。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后，送成都擎科梓熙生物測(cè)序，并將分離株lctO基因序列與GenBank中己知核酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)以確定其相似性。將已鑒定純化后的細(xì)菌接種于BHI肉湯，28 ℃ 條件下震蕩培養(yǎng) 18～24 h，將部分菌液用甘油保存于?20 ℃，部分菌液用脫脂奶粉凍干保存至?80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 鏈球菌相關(guān)基因的引物信息Table 1 Primer information of related gene ofStreptococcus

1.4 病原菌的毒力基因譜檢測(cè)

參照熊向英等[11]的方法設(shè)計(jì)合成S.iniae cfi毒力基因的引物，其余6個(gè)毒力基因scpI、simA、cpsD、sagA、pdi和pgm的擴(kuò)增引物則參照Baums等[13]和鄧夢(mèng)玲等[16]的方法設(shè)計(jì)合成(表1)，對(duì)分離株這些毒力基因進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。PCR體系及循環(huán)條件參照鄧夢(mèng)玲等[16]的程序進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將純化回收的PCR產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物測(cè)序。將獲得的分離菌毒力基因序列和GenBank中已知核酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.5 病原菌的分型

對(duì)17株鱘源海豚鏈球菌以及海豚鏈球菌ATCC 29178進(jìn)行以下分型：

精氨酸雙水解酶(Arginine dihydrolase，ADH)分型參照 API STREP 20鑒定系統(tǒng)使用說明書進(jìn)行。

RAPD分型根據(jù)Bachrach等[10]的方法，以5′-GATCAAGTCC-3′為引物，對(duì)海豚鏈球菌進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，25 μL 反應(yīng)體系中含 2 μL 模板 DNA，2 μL 引物，12.5 μL PCR Master Mix(2×)，8.5 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性 5 min；95 ℃ 變性 30 s，38 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。

基因組REP-PCR參照Malathum等[18]的方法，以 5′-ACGTGGTTTGAAGAGATTTTCG-3′為引物，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性 7 min；90 ℃ 變性 30 s，40 ℃ 退火 1 min，65 ℃ 延伸 8 min，35 個(gè)循環(huán)；65 ℃延伸16 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠于90 V電壓電泳20 min，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。獲得的圖像運(yùn)用Quantity One v.4.62軟件處理，選擇UPGAMA聚類方法和條帶位置差異容許度(Position tolerance)方法，條帶位置差異容許度選擇0.85%，優(yōu)化值選擇0.5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與鑒定

2016—2018 年從四川雅安、彭州、邛崍、蒲江等鱘魚養(yǎng)殖地分離到17株海豚鏈球菌，菌株詳細(xì)信息見表2。在BHI平板28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)細(xì)菌24 h后，形成邊緣光滑的乳白色菌落，為革蘭陽性鏈狀球菌(圖1)，lctO基因特異性檢測(cè)為陽性(圖2)，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示分離菌與GenBank數(shù)據(jù)庫中S.iniae的相似性最高，達(dá)99%以上。

表2 四川患病鱘魚中分離的海豚鏈球菌的信息Table 2 The information ofStreptococcus iniae isolated from diseased sturgeon in Sichuan

2.2 病原菌的分型

ADH 反應(yīng)結(jié)果顯示菌株 1、6、9、11、12、16、17和18為ADH陽性，其余菌株為ADH陰性，說明彭州地區(qū)的分離株大部分為ADH陽性，而雅安、蒲江以及大部分來自邛崍的分離株則為ADH陰性。

圖1 海豚鏈球菌分離株革蘭染色的顯微形態(tài)Fig.1 Micromorphologies of isolated strains ofStreptococcus iniae in Gram staining

圖2 海豚鏈球菌分離株lctO基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR-amplifiedlctO genes from isolated strains ofStreptococcus iniae

通過對(duì)試驗(yàn)株進(jìn)行RAPD分析顯示出與ADH分型相似的結(jié)果，18株菌可分成2個(gè)基因型：Ⅰ型和Ⅱ型。其中雅安、蒲江、邛崍等地的分離株擴(kuò)增出750 bp條帶，屬于Ⅰ型；而彭州地區(qū)的分離株未擴(kuò)出750 bp條帶，屬于Ⅱ型(圖3)。

圖3 海豚鏈球菌分離株的RAPD擴(kuò)增圖譜Fig.3 RAPD profiles of isolated strains ofStreptococcus iniae

通過對(duì)菌株進(jìn)行REP-PCR(圖4)聚類分析，18株菌共分為4個(gè)基因型：A、B、C、D型。菌株1、3、4、5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17 號(hào)為 D 型，2號(hào)菌株為B型，10、11號(hào)菌株為C型，18號(hào)菌株為A型，由此可見，D型為四川地區(qū)的優(yōu)勢(shì)流行型。

2.3 病原菌的毒力譜檢測(cè)

對(duì)18株海豚鏈球菌進(jìn)行毒力譜檢測(cè)，結(jié)果(圖5、圖 6)顯示pgm、scpI、pdi、cpsD、sagA和cfi基因符合預(yù)期片段，經(jīng)測(cè)序鑒定為S.iniae。simA基因檢測(cè)1號(hào)和2號(hào)菌株擴(kuò)增出的條帶符合預(yù)期結(jié)果，而3～18號(hào)菌株擴(kuò)增出255 bp左右的條帶，2號(hào)菌株和其他隨機(jī)選取的3個(gè)菌株進(jìn)行測(cè)序鑒定，4株菌擴(kuò)增出的條帶均為simA基因，相似性高達(dá)98%以上。將隨機(jī)挑選菌株2、3、9和18的simA基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化測(cè)序后上傳NCBI數(shù)據(jù)庫，并獲得登錄號(hào)MK959355、MK973066、MK973067 和 MK973068。

圖4 基于REP-PCR對(duì)18株海豚鏈球菌進(jìn)行聚類分析Fig.4 Clustering analysis of 18Streptococcus iniae strains based on REP-PCR

圖5 海豚鏈球菌毒力基因的多重PCR檢測(cè)Fig.5 Multi-PCR analysis of virulence genes fromStreptococcus iniae

圖6 海豚鏈球菌毒力基因cfi的PCR檢測(cè)Fig.6 PCR analysis ofcfi virulence gene fromStreptococcusiniae

3 討論與結(jié)論

S.iniae作為魚類養(yǎng)殖中的主要致病菌[19]，對(duì)世界鱘魚養(yǎng)殖造成重大影響，目前有關(guān)S.iniae致病機(jī)制的研究主要包括動(dòng)物感染模型的建立[20-21]，感染后海豚鏈球菌在各組織的分布情況等[22-23]。現(xiàn)已證實(shí)S.iniae具有多種毒力因子[14]：主要通過調(diào)理作用使海豚鏈球菌免于巨噬細(xì)胞吞噬的莢膜和M樣蛋白[14]；參與細(xì)胞壁和莢膜的生物合成，并能抵抗正電性抗菌肽的磷酸葡萄糖苷酶(pgmA)[24]；損傷宿主紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的細(xì)胞溶血素(sagA)[25]；水解中性粒細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)物補(bǔ)體因子C5a，從而損傷宿主具抗侵襲能力的C5a肽酶[26]；增強(qiáng)細(xì)菌的抵抗力，并對(duì)宿主上皮細(xì)胞進(jìn)行黏附和入侵的脫乙酰基酶[27]；攔截抗體向補(bǔ)體呈遞抗原的CAMP因子[28]等。這些毒力因子相互作用幫助S.iniae侵入宿主，逃避宿主的防御，引起宿主發(fā)病[29]。本研究對(duì)四川地區(qū)分離的17株鱘源海豚鏈球菌以及參考菌株進(jìn)行7種主要毒力基因的檢測(cè)，所有菌株均為陽性，其毒力譜均為pgm/scpI/simA/cpsD/saga/pdi/cfi，這表明了四川地區(qū)的鱘源海豚鏈球菌分離株均有較強(qiáng)的毒力。相關(guān)研究表明編碼M樣蛋白的simA基因是高度保守的毒力因子[30]，其主要作用是幫助細(xì)菌黏附并入侵宿主各器官，同時(shí)還能抵抗宿主巨噬細(xì)胞的吞噬，并引起炎癥反應(yīng)。S.iniae感染往往造成魚類宿主的急性死亡，而缺失simA基因的突變株抗吞噬能力明顯降低[31]。本研究發(fā)現(xiàn)2016年后四川地區(qū)的分離株simA基因均發(fā)生了變異，經(jīng)測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)變異菌株的simA基因有部分序列的缺失，但simA基因變異發(fā)生的原因，以及變異對(duì)菌株毒力的影響還不清楚，這值得進(jìn)一步的探究。

由于S.iniae各菌株分型復(fù)雜，又無法用Lancefield鏈球菌血清分類法進(jìn)行分型[32]，因此S.iniae究竟有多少種血清型尚不清楚。Barnes等[33]根據(jù)S.iniae對(duì)ADH的反應(yīng)將以色列的分離株分成2種生物型，但隨著研究的深入，該分型已無法滿足需要。RAPD分析是建立在PCR基礎(chǔ)上的一種可對(duì)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)，它不僅能反映生物個(gè)體間的遺傳穩(wěn)定性，也能敏感地反映出遺傳差異。Bachrach等[10]通過研究發(fā)現(xiàn)生物Ⅰ型(ADH陽性)菌株在RAPD擴(kuò)增中出現(xiàn)750 bp大小的條帶，而生物Ⅱ型則不能擴(kuò)增出，但我國多位學(xué)者先后對(duì)各地的S.iniae分離株進(jìn)行分析的結(jié)果卻不完全支持上述觀點(diǎn)。黃婷等[34]和熊向英等[11]研究發(fā)現(xiàn)廣西的分離株ADH反應(yīng)為陰性，在RAPD擴(kuò)增中卻有750 bp大小的條帶；周素明[35]的研究中分離株屬于2個(gè)生物類群，但ADH反應(yīng)均為陽性。本研究中部分菌株雖然為ADH陽性，但RAPD不能擴(kuò)增出750 bp大小的條帶，而有部分ADH陰性菌株卻能擴(kuò)增出750 bp的條帶。為了進(jìn)一步從分子水平上比較分離株，本研究采用REP-PCR進(jìn)行分析，該方法是通過擴(kuò)增細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列，來揭示基因組間的差異。與RAPD相比，該方法可以更為準(zhǔn)確地反映菌株間的差異。通過該方法將試驗(yàn)菌株明顯分成了4個(gè)基因型。其中菌株9～12以及16～18在RAPD分型中為同一型，而REP-PCR分析則分成3個(gè)基因型。值得注意的是菌株9～12為不同時(shí)間同一地點(diǎn)的不同分離株，其遺傳特征存在明顯的差異，菌株16～18為同一地點(diǎn)相同時(shí)間的不同分離株，其遺傳特征也存在多樣性，這也進(jìn)一步證實(shí)了四川地區(qū)存在多種基因型的菌株。同一環(huán)境中的多種血清型或基因型的菌株有利于菌株的基因重組或變異，而這種基因的重組或變異則可能增加病原菌突破宿主防御的能力和致病力，四川地區(qū)近年海豚鏈球菌對(duì)鱘魚的危害越來越大是否與不同基因型的菌株共存導(dǎo)致基因突變有關(guān)，還需要探索。我們的研究發(fā)現(xiàn)四川海豚鏈球菌simA基因發(fā)生了變異，至于其他功能性基因有無變異，從而影響其致病力值得進(jìn)一步研究。