董林，包進(jìn)，徐菲，趙昕亞

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院 南京市第一醫(yī)院，南京210006

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，臨床所用的藥物不斷增多，特別是抗菌藥物應(yīng)用越來越多，藥物引起的血液學(xué)改變特別是其導(dǎo)致的溶血性貧血逐漸引起重視。藥物引起的溶血主要有四種類型，包括紅細(xì)胞酶缺乏、血紅蛋白不穩(wěn)定、藥物的毒性作用及免疫性溶血(DIHA)[1,2]。DIHA是一種由IgG或IgM介導(dǎo)的細(xì)胞毒性抗體的Ⅱ類變態(tài)反應(yīng)，主要的發(fā)病機(jī)制是產(chǎn)生相應(yīng)的抗藥物抗體，隨著藥物再次使用可能導(dǎo)致溶血的發(fā)生。DIHA與藥物活性無關(guān)，主要是由于長時間或與大量藥物接觸造成的[3]。抗菌類藥物的這種溶血不良反應(yīng)最為常見[4,5]，其中又以二代或三代的頭孢菌素類藥物所占比例最大[6]。臨床上對于出現(xiàn)免疫性溶血多考慮為自身免疫系統(tǒng)變化如自身抗體出現(xiàn)，而由于檢驗科或輸血科對免疫抗體的篩查主要集中在血型抗體類，同時因為檢驗手段缺乏，并不能準(zhǔn)確檢測出藥物性抗體的存在。因此，本研究針對我院使用較多的三種β-內(nèi)酰胺類抗生素(頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉、頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉、美羅培南)，應(yīng)用藥物包被紅細(xì)胞的方法，通過微柱凝膠法檢測藥物性抗體?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者入選標(biāo)準(zhǔn)：住院注射使用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉、頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉、美羅培南3 d以上；使用藥物前，不規(guī)則抗體、直接抗人球蛋白檢測、藥物性抗體檢測均為陰性；住院前均未接受口服或靜脈注射抗菌藥物治療。采集患者空腹靜脈血3 mL，共獲得EDTA-K2抗凝血標(biāo)本258例，其中使用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉者120例、使用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉者56例、使用美羅培南者82例。離心分離血漿和壓積紅細(xì)胞備用。

1.2 試劑與儀器 微柱凝膠抗球蛋白檢測卡、不規(guī)則抗體篩檢細(xì)胞購自長春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司。注射用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉(2.25 g/瓶)購自湘北威爾曼制藥有限公司。注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉購自?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰?。注射用美羅培南(0.25 g/瓶)購自深圳海濱制藥有限公司。O型健康人紅細(xì)胞紅細(xì)胞來自南京市紅十字血液中心健康獻(xiàn)血者血源。0.9%氯化鈉注射液購自安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司。巴比妥緩沖液、PBS緩沖液購自南京信帆生物技術(shù)有限公司。標(biāo)本離心機(jī)購自北京白洋醫(yī)療器械公司。微柱凝膠卡專用離心機(jī)、孵育器購自長春博研科學(xué)儀器有限責(zé)任公司。

1.3 不規(guī)則抗體篩查 將樣本血漿/放散液50 μL和不規(guī)則抗體篩檢細(xì)胞50 μL加入微柱凝膠抗球蛋白檢測卡中，37 ℃孵育15 min，900 r/min離心2 min，1 500 r/min離心3 min，讀取結(jié)果。不規(guī)則抗體陽性的樣本不進(jìn)行藥物抗體篩查。

1.4 紅細(xì)胞直接抗球蛋白試驗(DAT)及放散實驗 患者壓積紅細(xì)胞用生理鹽水稀釋成濃度為0.8%的紅懸液，取50 μL加入含有抗人球蛋白試劑的微柱凝膠卡中，專用離心機(jī)離心后判斷DAT結(jié)果。所有DAT陽性的患者樣本，吸取100 μL壓積紅細(xì)胞，生理鹽水洗滌3次，加入等體積的生理鹽水，放入56 ℃震蕩水浴箱10 min，迅速離心分離放散液，對放散液進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查。

1.5 藥物包被紅細(xì)胞的制備[7]和藥物性抗體檢測 藥物0.1 g溶于0.25 mL、pH 9.6～9.8的巴比妥緩沖液中，同時加入洗滌后的3份混合后O型壓積紅細(xì)胞170 μL；另取試管加入同樣的壓積紅細(xì)胞和巴比妥緩沖液。室溫孵育1 h，期間反復(fù)混勻數(shù)次，離心去除上清液后，用PBS緩沖液洗滌保存于4 ℃環(huán)境中。用生理鹽水洗滌藥物包被后的紅細(xì)胞，并稀釋成2%濃度。取微柱凝膠抗人球蛋白卡，加入相應(yīng)的血漿/放散液和藥物包被紅細(xì)胞(見表1)。37 ℃孵育、900 r/min離心2 min、1 500 r/min離心3 min，判定結(jié)果。頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉和頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉使用者孵育時間為60 min、美羅培南使用者為15 min。

表1 藥物包被法微柱凝膠卡加入的血漿和紅細(xì)胞

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用百分率表示，采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不規(guī)則抗體篩查結(jié)果 所有258例樣本血漿中不規(guī)則抗體篩查均為陰性。

2.2 紅細(xì)胞DAT檢測和放散液不規(guī)則抗體檢測 258例樣本中DAT陽性38例，其中使用美羅培南18例、頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉20例，使用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉者無DAT陽性出現(xiàn)。DAT陽性38例進(jìn)行放散液不規(guī)則抗體檢測，發(fā)現(xiàn)不規(guī)則抗體陽性6例，其中美羅培南1例、頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉5例。

2.3 DAT陰性樣本的藥物性抗體檢測結(jié)果 共檢測出DAT陰性220例，其中使用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉100例、頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉56例、美羅培南64例。220例樣本血漿檢測出藥物性抗體26例，其中頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉和頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉各12例、美羅培南2例，美羅培南陽性率低于其余兩類抗生素(P均<0.05)。將26例DAT陰性和血漿藥物性抗體陽性標(biāo)本的紅細(xì)胞放散液行藥物性抗體和不規(guī)則抗體檢測，發(fā)現(xiàn)均為不規(guī)則抗體陰性和藥物抗體陽性(頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉、頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉、美羅培南分別為12、12、2例)，其余194例樣本紅細(xì)胞放散液的不規(guī)則抗體和藥物抗體均為陰性(頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉、頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉、美羅培南分別為88、44、62例)。

2.4 DAT陽性樣本藥物性抗體檢測結(jié)果 DAT陽性38例中，使用美羅培南18例，血漿中未檢測出藥物性抗體，17例不規(guī)則抗體陰性的放散液中檢測出2例藥物抗體；頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉20例，血漿中檢測出藥物性抗體2例，15例不規(guī)則抗體陰性的放散液中檢測出藥物性抗體2例(即血漿中檢測出藥性物抗體的2例)。

3 討論

DIHA根據(jù)其免疫機(jī)制的不同主要有四種類型[8]：自身抗體型、非免疫蛋白吸附型、半抗原型、免疫復(fù)合物型。前兩者是藥物進(jìn)入機(jī)體改變紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解；后兩種是形成藥物性抗體，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，這種藥物性抗體也是抗菌藥物導(dǎo)致藥物誘導(dǎo)免疫性溶血性貧血發(fā)生的最為主要的機(jī)制[9]。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有抗菌活性強、毒性低、品種多及適用范圍廣等優(yōu)點，在臨床得到廣泛應(yīng)用，隨之而來的不良反應(yīng)也呈快速增長，特別是用藥后出現(xiàn)的不明原因的血紅蛋白下降和膽紅素升高等情況，有研究認(rèn)為應(yīng)考慮為藥物性抗體所引起[10]。頭孢類、碳青霉烯類都具有β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，屬于β-內(nèi)酰胺類抗生物[11,12]。美羅培南是20世紀(jì)90年代面市的第二代碳青霉烯類抗生素[13]。注射用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉和頭孢噻肟均為第三代頭孢菌素類抗生素[14,15]。頭孢曲松也被認(rèn)為是除頭孢替坦和哌拉西林/舒巴坦以外引起溶血性貧血頻率最高的抗菌藥物[16]，其機(jī)制可能是頭孢曲松鈉作為半抗原與紅細(xì)胞及血清中蛋白質(zhì)形成全抗原，產(chǎn)生抗體與紅細(xì)胞膜上的藥物反應(yīng)，導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞而發(fā)生溶血[17]。對于頭孢噻肟和美羅培南導(dǎo)致的紅細(xì)胞破壞，其機(jī)制尚未明確，僅有少量的病例報道[18]。

對于IgG或IgM類抗體的檢測，輸血科或檢驗科通常會利用抗球蛋白試驗來完成，結(jié)合有分子篩作用的微柱凝膠更增加了其靈敏度。血漿或紅細(xì)胞放散液中IgG或IgM類的抗體較為多見的是血型相關(guān)的不規(guī)則抗體，這也是輸血科運用抗球蛋白試驗最為主要的檢驗項目。本研究通過將血型相關(guān)不規(guī)則抗體篩檢細(xì)胞、樣本血漿/放散液結(jié)合微柱凝膠抗球蛋白卡的間接抗球蛋白實驗，對所有試驗樣本的血漿進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查，未發(fā)現(xiàn)陽性存在，可以初步排除血漿中有血型相關(guān)不規(guī)則抗體存在的情況。再運用DAT對紅細(xì)胞進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)共有38例陽性，其中使用美羅培南18例、頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉有20例，使用頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉者無陽性出現(xiàn)；進(jìn)一步通過間接抗球蛋白試驗對放散液檢測血型相關(guān)不規(guī)則抗體，發(fā)現(xiàn)使用美羅培南1例陽性、頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉5例陽性，這6例陽性可能是由于血型相關(guān)不規(guī)則抗體吸附于紅細(xì)胞表面造成，其余的32例DAT陽性則可能有藥物性抗體的存在。

有報道指出，大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素可以通過包被紅細(xì)胞從而檢測其藥物性抗體[19]。而當(dāng)血清中有IgG或IgM類藥物抗體存在，可以與相應(yīng)的藥物包被的紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，在凝膠中的抗人IgG抗體的橋連作用下，形成紅細(xì)胞的凝塊，離心后并不能通過凝膠從而沉積到凝膠上端，未凝集的紅細(xì)胞沉積到凝膠底部[20]。本研究根據(jù)《人類紅細(xì)胞血型學(xué)實用理論和實驗技術(shù)》介紹的方法，建立藥物包被紅細(xì)胞試劑，對258例樣本的血漿和32例非血型相關(guān)不規(guī)則抗體的DAT陽性的紅細(xì)胞放散液進(jìn)行藥物性抗體檢測。220例DAT陰性的血漿樣本中26例藥物性抗體陽性；同時對這26例的紅細(xì)胞進(jìn)行放散，放散液中也呈藥物性抗體陽性，其中使用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉和頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉各12例，陽性率均高于使用美羅培南者(2例)，說明頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉和頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉導(dǎo)致藥物性抗體產(chǎn)生的可能性高于美羅培南。在38例DAT陽性的樣本中，使用頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉2例血漿和紅細(xì)胞放散液中藥物性抗體呈陽性；DAT陽性的美羅培南組血漿藥物性性抗體均為陰性，但有1例其放散液中藥物性抗體呈陽性，我們考慮可能是由于其藥物性抗體被紅細(xì)胞吸附而未在血漿中出現(xiàn)或血漿中效價太低無法檢測出。因此，在258例使用β-內(nèi)酰胺類抗生素的患者中，血漿和(或)放散液中藥物性抗體陽性的29例，應(yīng)該是由于藥物性抗體存在而導(dǎo)致的。

一直以來，臨床上對于貧血較嚴(yán)重的患者，很多時候會通過輸注紅細(xì)胞來糾正貧血，而對于輸注后血紅蛋白不能有效升高、甚至出現(xiàn)溶血者，更多考慮病情發(fā)展或自身免疫性的可能，較少考慮抗菌藥物的影響。目前大部分輸血科將微柱凝膠抗人球蛋白技術(shù)用于不規(guī)則抗體篩檢和交叉配血過程中，而本研究團(tuán)隊利用該技術(shù)原理檢測藥物性抗體，發(fā)現(xiàn)美羅培南、頭孢曲松鈉他唑巴坦鈉、頭孢噻肟鈉舒巴坦鈉三種藥物使用均會導(dǎo)致藥物性抗體的出現(xiàn)，從而可能造成紅細(xì)胞溶解而出現(xiàn)溶血性貧血。這種藥物性抗體檢測方法為臨床使用上述三種藥物提供了另一種思路，也可以為臨床使用抗菌藥物提供另一種依據(jù)。