李曉梅, 宋金艷, 陳 芳, 徐 林, 李天禹, 羅 清

乳腺癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]?；熤委熑橄侔┠軌蛴行p少患者復發(fā)率與死亡率，但長期應(yīng)用易產(chǎn)生多藥耐性(multidrug resistance，MDR)[2]。克服化療藥物耐藥性是治療乳腺癌需解決的難點與關(guān)鍵。針對這一難題，研究人員從多個角度進行了有益探索，其中，從天然藥物中尋找高效、低毒、作用靶點廣泛的腫瘤 MDR 逆轉(zhuǎn)劑己成為目前臨床研究的重點[3]。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有安全、價廉、毒副作用小等優(yōu)點。中醫(yī)或中西醫(yī)結(jié)合的治療手段貫穿乳腺癌治療的整個歷程，并且發(fā)現(xiàn)這些方法在逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR方面作用不可忽視[4-5]。消乳散結(jié)湯是李天禹教授[6]根據(jù)多年臨床經(jīng)驗結(jié)合貴州本地的中藥特點創(chuàng)制的經(jīng)驗方，對乳腺癌輔助治療具有很好的療效。通過查閱相關(guān)文獻，該研究篩選出消乳散結(jié)湯方劑中具有抑制腫瘤生長，但在逆轉(zhuǎn)乳腺癌MDR方面無相關(guān)文獻報道的有效單體，分別為熟地黃、白芍、梔子、半枝蓮以及浙貝母五味候選單藥。隨后，對五種候選單藥在逆轉(zhuǎn)乳腺癌MDR方面進行了初步的探索，以期尋找具有MDR逆轉(zhuǎn)作用的藥物，為臨床治療MDR乳腺癌提供理論依據(jù)及新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株與中藥本實驗中使用的人乳腺癌細胞敏感株MCF-7由遵義醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究室提供，人乳腺癌阿霉素耐藥細胞MCF-7/ADR購于上海銀紫晶生物科技有限公司；MCF-7和MCF-7/ADR兩種細胞均用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃條件下進行培養(yǎng)。消乳散結(jié)湯中的五種單藥白芍、梔子、浙貝母、半枝蓮以及熟地黃均由遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中藥局提供，并由遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中醫(yī)科王剛老師進行鑒定。各單藥均用常規(guī)水煎煮，經(jīng)過濾、超濾除去雜質(zhì)和細菌后，在無菌環(huán)境下將藥液濃縮制備成凍干粉，然后將其用PBS配制成1 mg/ml的貯存液備用。

1.2 實驗試劑與儀器阿霉素(adriacin, ADR)(深圳萬樂藥業(yè)有限公司)和MTT(美國Sigma-Aldrich公司)用PBS(pH =7.4)分別配制成1 mg/ml和5 mg/ml的貯存液。所有貯存液于0.22 μm濾器過濾除菌后，-20 ℃避光保存。胎牛血清(上海生工生物工程股份有限公司); RPMI 1640完全培養(yǎng)基(美國Hyclon公司); 倒置顯微鏡CKX41(日本OlymPus公司); 多功能酶標儀318(上海三科儀器有限公司); CO2培養(yǎng)箱FormaTMⅡ3111(美國Thermo公司); 雙蒸水制備系統(tǒng)(美國MilliPore公司)。

1.3 ADR處理下MCF-7敏感株IC50的檢測實驗設(shè)置空白組、親本組和不同濃度ADR組(1、2、4、8、16、32 μg/ml)。第1天取增殖旺盛的對數(shù)生長期MCF-7細胞，用0.25%的胰酶消化后輕輕吹打制備成單細胞懸液。親本組和ADR組以每孔100 μl體積、5×103個細胞密度接種于96孔板，37 ℃、5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)過夜。第2天吸棄兩組舊培養(yǎng)基，新增空白組，并在空白組和親本組中每孔加入100 μl新的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，ADR組則每孔加入100 μl稀釋到相應(yīng)濃度ADR的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。3組均繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μl MTT貯存液，再培養(yǎng)4 h后棄上清液,每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),避光振蕩10 min,酶標儀檢測492 nm波長處吸光值(OD值)。采用以下公式計算：ADR對MCF-7細胞的抑制率，并計算IC50值：細胞生長抑制率(%)=(親本組OD值-實驗組OD值)/(親本組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4 ADR處理下MCF-7/ADR細胞IC50的檢測與耐藥倍數(shù)的計算實驗設(shè)置空白組、親本組、ADR組(6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml)，每組6個復孔。同樣采用MTT增殖實驗法檢測并計算MCF-7/ADR細胞的IC50值，具體方法參照1.3。采用以下公式計算MCF-7/ADR耐藥倍數(shù)：細胞耐藥倍數(shù)=耐藥細胞株IC50/敏感細胞株IC50。

1.5 消乳散結(jié)湯各候選單藥對MCF-7/ADR細胞無毒劑量的檢測實驗設(shè)置空白組、親本組、候選單藥組(0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%貯存液濃度)，每組6個復孔。實驗方法同1.3，計算各候選單藥對MCF-7/ADR細胞IC10。

1.6 無毒劑量下對各候選單藥逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細胞耐藥作用檢測實驗分為空白組、ADR單獨處理組、單藥(濃度依據(jù)1.5項所測IC10選取 )+ADR組(6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml)。測量各候選單藥聯(lián)合不同濃度ADR組處理下MCF-7/ADR細胞IC50，按照以下公式分別計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)及逆轉(zhuǎn)率。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=ADR單獨處理組IC50/(ADR+單藥聯(lián)合處理組)IC50；逆轉(zhuǎn)率=[ADR單獨處理組IC50-(ADR+單藥聯(lián)合處理組)IC50]/ADR單獨處理組IC50×100%。上述每組實驗均獨立重復3次。

2 結(jié)果

2.1 MCF-7細胞和MCF-7/ADR細胞的形態(tài)學觀察MCF-7與MCF-7/ADR細胞均采用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。MCF-7細胞貼壁生長，邊界清楚，呈多邊形，如圖1A所示。MCF-7/ADR細胞呈貼壁生長狀態(tài)，邊界較MCF-7細胞模糊，如圖1B所示。

2.2 MCF-7/ADR細胞耐藥倍數(shù)的檢測以4 μg/ml ADR處理MCF-7細胞48 h后，MCF-7細胞狀態(tài)明顯變差，細胞由多邊形變?yōu)閳A形，大量細胞從貼壁狀態(tài)變?yōu)榉琴N壁狀態(tài)，漂浮于培養(yǎng)基中，如圖1C所示；以40 μg/ml ADR作用于MCF-7/ADR細胞48 h后，MCF-7/ADR細胞形態(tài)稍變化，體積較未加ADR的親本細胞稍變小，如圖1D所示。

圖1 ADR作用前后MCF-7與MCF-7/ADR細胞形態(tài) ×100

利用MTT增殖實驗檢測不同濃度ADR對兩種細胞存活率的影響，繪制出相應(yīng)細胞的生長抑制率曲線。結(jié)果如圖2所示，隨著ADR濃度的增高，MCF-7和MCF-7/ADR細胞的生長受到明顯抑制，當ADR濃度達到一定劑量時對細胞生長的抑制趨勢逐漸趨于平緩。根據(jù)相應(yīng)公式計算出MCF-7細胞的IC50為(2.88±0.31) μg/ml，MCF-7/ADR細胞的IC50為(115.05±2.45) μg/ml，耐藥倍數(shù)為47倍。

2.3 消乳散結(jié)湯中各候選單藥對MCF-7/ADR無毒劑量測定各候選單藥在0.001%～10%濃度范圍內(nèi)對MCF-7/ADR細胞生長的影響，結(jié)果如表1所示，在0.001%～1%濃度下，消乳散結(jié)湯單藥梔子、白芍、半枝蓮、熟地黃、浙貝母對MCF-7/ADR細胞抑制率在±0.5%之間，對細胞生長無明顯影響，不具有毒害作用。因此，選取對細胞無毒性的低劑量(1 μg/ml)和高劑量(10 μg/ml)兩個濃度進行后續(xù)實驗。

圖2 不同濃度ADR對MCF-7和MCF-7/ADR細胞的生長抑制作用

2.4 消乳散結(jié)湯中各候選單藥對MCF-7/ADR細胞耐藥逆轉(zhuǎn)作用的檢測與ADR單獨作用的標準組相比，單藥浙貝母聯(lián)合ADR作用于MCF-7/ADR細胞，其ADR的IC50工作濃度明顯下降，在無毒劑量下選擇的中藥低劑量組與高劑量組耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.16與1.23，逆轉(zhuǎn)率分別為13.71%、18.77%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明在選取的無毒劑量作用下，浙貝母與ADR聯(lián)用時，對耐藥株MCF7/ADR具有明顯的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。

表1 各候選單藥對MCF-7/ADR細胞的生長抑制率(%)

而消乳散結(jié)湯中其他四味單藥白芍、梔子、熟地黃、半枝蓮，經(jīng)聯(lián)合ADR后作用于MCF-7/ADR細胞，與ADR單獨作用相比，耐藥的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)和逆轉(zhuǎn)率相近，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明在選取的無毒劑量作用下，這幾位中藥與ADR的聯(lián)用，對耐藥株MCF7/ADR不具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用，見表2、圖3。

圖3 高低劑量浙貝母聯(lián)合不同濃度ADR對MCF-7/ADR細胞生長抑制率

表2 單藥聯(lián)合ADR作用于MCF-7/ADR細胞的

3 討論

盡管乳腺癌治療取得了長足的進步，但乳腺癌患者的死亡率卻呈逐年上升趨勢，MDR是其主要原因之一。因此，逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞MDR是治療乳腺癌的新方向、新熱點，也是目前所面臨的最大挑戰(zhàn)。ADR作為化療的一線用藥，已廣泛應(yīng)用于各種化療方案治療乳腺癌，但長期應(yīng)用可能增加耐藥性，導致治療失敗[7]。越來越多的研究表明，生物活性天然產(chǎn)物可作為化療增敏劑，在逆轉(zhuǎn)MDR方面具有療效，Zhou et al[8]研究認為，苦參堿可通過PI3K / AKT信號通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7 / ADR細胞的MDR。因此，中醫(yī)藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑具有開發(fā)潛力和研究價值，并有可能成為新型抗癌劑。在本研究中，消乳散結(jié)湯是根據(jù)遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院李天禹教授多年治療乳腺癌臨床經(jīng)驗總結(jié)得出的經(jīng)驗方，對乳腺癌患者的治療具有一定療效，故本實驗主要對此經(jīng)驗方進行單藥分析，來研究消乳散結(jié)湯中梔子、白芍、半枝蓮、熟地黃以及浙貝母五種單藥對乳腺癌MCF-7 / ADR細胞耐藥逆轉(zhuǎn)方面作用，以期發(fā)現(xiàn)具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用的單藥為乳腺癌耐藥治療提供方向。

熟地黃[9]、白芍[10]、梔子[11]、半枝蓮[12]以及浙貝母[13]都有抗癌藥理活性。培米寧(PMI)是從浙貝母中提取的一種具有生物活性的成分。Tang et al[14]認為，與ADR組相比，PMI聯(lián)合ADR可通過抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡來提高胃癌化療中對ADR的藥物敏感性。為探討熟地黃、白芍、梔子、半枝蓮以及浙貝母四種單藥對MCF-7/ADR細胞的耐藥性影響，本研究選取各單藥對MCF-7/ADR細胞的無毒劑量，比較四種單藥分別聯(lián)合ADR干預(yù)MCF-7/ADR細胞與ADR單獨干預(yù)MCF-7/ADR細胞情況。結(jié)果顯示，與ADR單獨作用相比，單藥熟地黃、白芍、梔子和半枝蓮分別聯(lián)合ADR干預(yù)MCF-7/ADR細胞的IC50，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。然而，單藥浙貝母聯(lián)合ADR干預(yù)MCF-7/ADR細胞，細胞生長明顯受限，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明浙貝母可增強MCF-7/ADR細胞對ADR的敏感性，具有MDR逆轉(zhuǎn)作用。此結(jié)果與Tang et al[14]研究結(jié)果具有一致性。進一步研究結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)浙貝母聯(lián)合高劑量ADR組更能促進乳腺癌細胞凋亡，說明了其耐藥逆轉(zhuǎn)能力具有劑量相關(guān)性。本課題組將在此研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入研究浙貝母對耐藥逆轉(zhuǎn)的作用以及相關(guān)機制，為乳腺癌耐藥患者的治療提供新的思路。