王俊平 王艷麗 鐘雋鐫

[摘要]目的 利用16S rRNA測(cè)序技術(shù)，探討早期經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用抗生素不同療程對(duì)早產(chǎn)兒日齡28 d腸道微生物的影響。方法 選取2017年12月～2018年5月在廣東省婦幼保健院新生兒科住院治療的27例早產(chǎn)兒作為研究對(duì)象，其中使用青霉素+三代頭孢菌素≤3 d為短療程組（G1組，9例），使用青霉素+三代頭孢菌素≥7 d為長(zhǎng)療程組（G2組，18例）。收集28 d日齡的糞便標(biāo)本，采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)分析菌群組成的變化。結(jié)果 菌群的結(jié)構(gòu)組成中，主要的菌門包括放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門，其中厚壁菌門含量最為豐富。G1組中的擬桿菌門（0.03%）和變形菌門（34.11%）與G2組（0.04%、14.23%）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。G1組和G2組的alpha多樣性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。G1組中的β-變形菌綱（LDA=6.43，P=0.017）、叢毛單菌科（LDA=6.24，P=0.017）、皮桿菌科（LDA=6.60，P=0.016）、黃體桿菌屬（LDA=6.06，P=0.026）和韋榮球菌屬（LDA=7.51，P=0.049）高于G2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 早期經(jīng)驗(yàn)性、長(zhǎng)期應(yīng)用廣譜抗生素可能會(huì)導(dǎo)致早產(chǎn)兒腸道正常菌群的定植和達(dá)優(yōu)勢(shì)化時(shí)間延遲。

[關(guān)鍵詞]抗生素;腸道菌群;早產(chǎn);16S rRNA測(cè)序

[中圖分類號(hào)] R722.6 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1674-4721（2020）6（b）-0008-04

[Abstract] Objective To explore the influence of early empirical application of different treatment courses of antibiotic on the gut microbiota of 28-day-old preterm infants through 16S rRNA sequencing technology. Methods From December 2017 to May 2018， a total of 27 cases of hospitalized preterm infants in Guangdong Women and Children Hospital were enrolled， among them， penicillin + the third generation cephalosporin ≤ 3 days were selected as the short course group （the G1 group， 9 cases）， penicillin + the third generation cephalosporin ≥ 7 days were selected as the long course group （the G2 group， 18 cases）. The fecal samples at postnatal 28 days were collected， and 16S rRNA sequencing technology was used to analyze the changes of microbial community diversity. Results In the structural composition of the flora， the main phylum included Actinobacteria， Bacteroidetes， Firmicutes， and Proteobacteria， among which pachytene was the most abundant， the thick-walled mycoplasma was the most abundant. There were no significant differences in the Bacteroidetes and Proteobacteria between the G1 group （0.03%， 34.11%） and the G2 group（0.04%， 14.23%） （P>0.05）. There was no statistical difference in the alpha diversity between the G1 group and the G2 group （P>0.05）. Betaproteobacteria （LDA=6.43， P=0.017）， Comomamonadaceae （LDA=6.24， P=0.017）， Dermabacteraceae （LDA=6.60， P=0.016）， Luteibacter （LDA=6.06， P=0.026） and Veillonella （LDA=7.51， P=0.049） in the G1 group were higher than those in the G2 group， there were statistical differences （P<0.05）. Conclusion Early empirical and long-term application of broad-spectrum antibiotic may lead to the colonization of normal intestinal flora and the delay of the advantage of time in preterm infants.?

[Key words] Preterm infant; Gut microbiota; Antibiotic; 16S rRNA sequencing

宮內(nèi)感染是早產(chǎn)的一個(gè)常見(jiàn)原因，膿毒癥是早產(chǎn)兒死亡和發(fā)病的主要原因之一，許多早產(chǎn)兒出生就有感染的嫌疑。經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療是新生兒病房常見(jiàn)的預(yù)防和治療膿毒癥的方法[1]，但過(guò)多的抗生素治療對(duì)早產(chǎn)兒腸道菌群發(fā)育不利，可能對(duì)長(zhǎng)期健康造成不良影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，每使用抗生素治療1 d就會(huì)使晚發(fā)性敗血癥（LOS）、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）或死亡風(fēng)險(xiǎn)增加1.24倍[2]。目前，抗生素對(duì)早產(chǎn)兒腸道菌群影響的研究主要集中在對(duì)早產(chǎn)兒出生14 d內(nèi)的影響，而早產(chǎn)兒晚發(fā)性敗血癥和新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎更常發(fā)生于14 d之后，因此，了解抗生素對(duì)早產(chǎn)兒14 d之后腸道菌群的影響至關(guān)重要。本研究利用16S rRNA測(cè)序技術(shù)，旨在探討早期經(jīng)驗(yàn)性使用抗生素不同治療時(shí)間對(duì)早產(chǎn)兒出生后28 d腸道菌群結(jié)構(gòu)組成的影響。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年12月～2018年5月在廣東省婦幼保健院出生并住院治療的早產(chǎn)兒作為研究對(duì)象，研究期間符合入選標(biāo)準(zhǔn)的早產(chǎn)兒共34例，未達(dá)研究終點(diǎn)簽字出院或因其他原因死亡者7例，最終納入27例。將出生后24 h內(nèi)使用青霉素+三代頭孢菌素≤3 d的早產(chǎn)兒作為短療程組（G1組，9例），將出生后24 h內(nèi)使用青霉素+三代頭孢菌素≥7 d的早產(chǎn)兒作為長(zhǎng)療程組（G2組，18例）。兩組受試者的性別、胎齡、出生體質(zhì)量、分娩方式、母親產(chǎn)前抗生素使用、開(kāi)奶時(shí)間、NEC、LOS等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。本研究獲廣東省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且獲得患兒父母或法定監(jiān)護(hù)人的書面知情同意。早產(chǎn)兒經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用抗生素的指征：存在感染危險(xiǎn)因素（母親分娩時(shí)體溫≥38℃，胎膜早破>18 h，絨毛膜羊膜炎等）和臨床表現(xiàn)懷疑早期感染。新生兒敗血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《新生兒敗血癥診斷及治療專家共識(shí)》（2019年版）制訂[1]。G1組納入標(biāo)準(zhǔn)：①在我院出生的早產(chǎn)兒;②有經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療指征;③出生48 h內(nèi)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板、C反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原連續(xù)檢測(cè)2次，<2項(xiàng)陽(yáng)性，血培養(yǎng)陰性;④出生24 h內(nèi)使用青霉素+三代頭孢菌素≤3 d。G2組納入標(biāo)準(zhǔn)：①在我院出生的早產(chǎn)兒;②有經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用抗生素治療指征;③出生48 h內(nèi)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板、CRP、降鈣素原檢測(cè)，其中至少2項(xiàng)陽(yáng)性;④出生24 h內(nèi)使用青霉素+三代頭孢菌素，且應(yīng)用≥7 d。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床需要使用微生態(tài)制劑;②存在先天畸形、先天異常或遺傳代謝性疾病者。

1.2方法

1.2.1樣本提取、DNA提取、PCR和測(cè)序 ?使用無(wú)菌標(biāo)本瓶采集受試者出生后第28天的糞便樣本，量不少于5 g，未排便者使用開(kāi)塞露加生理鹽水通便。采集后立即冰凍于-20℃，并盡快凍存于-80℃冰箱。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Magen生物公司的HiPure Stool DNA Kit試劑盒說(shuō)明提取糞便細(xì)菌總DNA。提取好DNA的量用Nano Drop ND-1000分光光度計(jì)測(cè)定濃度，共分析糞便樣本27份。對(duì)濃度符合要求的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，主要針對(duì)性擴(kuò)增16S的V3～V4可變區(qū)，選用的擴(kuò)增引物是338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。PCR體系是50 μl，含有25 μl 2× Premix Taq，每種引物2 μl，DNA模板3 μl。PCR產(chǎn)物的完整性、片段長(zhǎng)度和濃度用1.0%的甘蔗凝膠電泳進(jìn)行檢查。濃度和條帶長(zhǎng)度符合預(yù)期范圍的樣品等濃度混合，然后上機(jī)Illumina Hiseq 2500平臺(tái)采用2×250的模式測(cè)序。

1.2.2數(shù)據(jù)分析 ?首先將利用Trimmomatic軟件[3]測(cè)序得到的Raw Reads進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，過(guò)濾掉含N、質(zhì)量值低于20及過(guò)濾后序列長(zhǎng)度低于100 bp的reads。質(zhì)控后的clean reads利用FLASH軟件[4]基于overlap關(guān)系進(jìn)行拼接?；趏verlap區(qū)允許最大錯(cuò)配率為0.1，利用軟件Mothur[5]對(duì)序列進(jìn)行樣品對(duì)分配，同時(shí)控制barcode的最大錯(cuò)配數(shù)為2，最大引物錯(cuò)配數(shù)為3進(jìn)行篩選。隨后利用軟件usearch[6]將篩選得到的tags進(jìn)行聚類，97%及以上的一致性序列聚成一個(gè)OTU，在usearch聚類的同時(shí)，去除含嵌合體的tags。最后利用軟件QIIME[7]中的assign_taxonomy.py基于Silva數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行物種注釋，并去掉注釋為葉綠體或線粒體及不能注釋的OTU，最終得到序列注釋表。樣品的alpha多樣性指數(shù)用QIIME的alpha_diversity.py完成，beta diversity的距離利用QIIME中的beta_diversity.py計(jì)算得到。軟件LEfSe[7]用于進(jìn)行差異菌群的分析，閾值設(shè)定LDA≥2。

1.3觀察指標(biāo)

采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)出生后28 d齡糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，考察出生后經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用不同抗生素及不同治療時(shí)間對(duì)早產(chǎn)兒腸道菌群的影響，主要觀察指標(biāo)包括菌群的結(jié)構(gòu)組成、菌落的多樣性及差異菌。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用Fisher精確檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組菌群結(jié)構(gòu)組成的分析

在所有研究樣本中，主要的菌門包括放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria），詳見(jiàn)圖1A（封三）。其中厚壁菌門含量最為豐富，其在G1組的中位數(shù)值為65.54%，基本與G2組無(wú)區(qū)別（66.60%，P=0.18）。同時(shí)擬桿菌門在兩組中也基本無(wú)變化（0.03% vs.0.04%，P=0.96）。放線菌門在G1組的中位數(shù)值為0.16%，略低于G2組的0.25%（P=0.14）。此外，變形菌門（34.11% vs.14.23%，P=0.25）含量在G2中比G1組亦有所增加。主要菌屬包括擬桿菌屬（Bacteroides）、艱梭菌屬（Clostridioides）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）、腸桿菌屬（Enterobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、埃希菌屬（Escherichia）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、Robinsoniella屬、鏈球菌屬（Streptococcus）和韋榮球菌屬（Veillonella），詳情見(jiàn)圖1B（封三）。相比于G1組，G2組中的擬桿菌屬（0.016% vs. 0.029%，P=0.46）、梭狀芽孢桿菌屬（0.97% vs. 1.06%，P=0.84）、埃希菌屬（0.27% vs. 1.38%，P=0.09）、克雷伯菌屬（0.32% vs. 2.06%，P=0.67）和艱梭菌屬（0.36% vs. 0.47%，P=0.70）含量的中位數(shù)值含量有所下降。與之相反的是，鏈球菌屬的中位數(shù)值（1.00% vs. 0.41%，P=0.59），腸球菌屬（2.06% vs. 1.34%，P=0.33）和Robinsoniella屬（0.90% vs. 0.30%，P=0.09）含量的中位數(shù)值在G2組中相對(duì)較高。

2.2兩組菌落多樣性的比較

alpha多樣性綜合菌群的種類和含量的均一性常用Shannon和Simpson兩個(gè)指數(shù)來(lái)表征。G1組中的Shannon指數(shù)平均值為2.43±1.03，與G2組的2.41±1.04比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.96）（圖2A，封三）。同時(shí)，G1組中Simpson指數(shù)的平均值為0.38±0.20，與G2組的0.61±0.22比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.79）（圖2A，封三）。為了分析菌群整體的差異，本研究進(jìn)行了PCoA分析，結(jié)果見(jiàn)圖2B（封三），圖中顯示G1組與G2組的樣品重疊在一起，未能區(qū)分開(kāi)，顯示兩組樣品的菌群結(jié)構(gòu)較為接近。

2.3兩組差異菌的比較

為了近一步分析G1組與G2組的菌群差異，本研究利用LEfSe軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)G1組中的β-變形菌綱（Betaproteobacteria，LDA=6.43，P=0.017）、叢毛單菌科（Comamonadaceae，LDA=6.24，P=0.017）、皮桿菌科（Dermabacteraceae，LDA=6.60，P=0.016）、黃體桿菌屬（Luteibacter，LDA=6.06，P=0.026）和韋榮球菌屬（Veillonella，LDA=7.51，P=0.049）顯著高于G2組（圖3，封四）。

3討論

早產(chǎn)兒腸道功能不完善，腸道菌群定植明顯延遲，使得其微生物群更容易受到破壞[8]。由于早產(chǎn)兒免疫功能不完善、對(duì)感染抵抗力差，且早發(fā)敗血癥診斷困難，常需要出生后即開(kāi)始經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用第三代頭孢菌素等廣譜抗生素。因第三代頭孢菌素抗菌譜廣，可能導(dǎo)致早產(chǎn)兒腸道菌群定植的模式及數(shù)量發(fā)生異常改變，從而增加早產(chǎn)兒新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、誘導(dǎo)耐藥產(chǎn)生、繼發(fā)真菌感染等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生率，導(dǎo)致早產(chǎn)兒病死率增高。已有研究顯示，早產(chǎn)兒腸道菌群的建立及細(xì)菌的異常定植與LOS和NEC有關(guān)[9-10]。本研究結(jié)果顯示，G2組有4例NEC，2例LOS，G1組無(wú)NEC和LOS病例。

早產(chǎn)兒微生物群的多樣性比足月新生兒更有限，早產(chǎn)兒腸道正常菌群的定植明顯延遲，達(dá)優(yōu)勢(shì)化時(shí)間也延遲;與足月新生兒相比，差異包括厭氧菌減少、厚壁菌和變形菌的豐度增加、擬桿菌的豐度減少以及雙歧桿菌定植時(shí)間的顯著延遲[11-12]。有研究顯示，在使用抗生素和不使用抗生素的對(duì)照嬰兒之間的alpha多樣性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]。本研究結(jié)果顯示，在日齡28 d時(shí)，兩組腸道菌群的alpha多樣性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與本研究樣本量少、早產(chǎn)兒胎齡較低及均使用抗生素有關(guān)。

在腸道菌群結(jié)構(gòu)組成方面，本研究結(jié)果顯示兩組早產(chǎn)兒的腸道菌群均以厚壁菌門和變形菌門為主，擬桿菌門和放線菌門的豐度較低，且本研究未檢測(cè)到顯著的雙歧桿菌;G2組的專性厭氧菌中的擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬含量降低，埃希菌屬、克雷伯菌屬相對(duì)豐度低;而腸球菌屬在G2組的比例高于G1組，這與唐小麗等[14]和朱丹萍等[15]的研究結(jié)果一致。腸球菌細(xì)胞壁堅(jiān)厚，對(duì)許多抗菌藥物大多表現(xiàn)為固有耐藥，抗生素可將腸道內(nèi)共生菌殺滅，從而導(dǎo)致了上述耐藥細(xì)菌及致病菌的過(guò)度生長(zhǎng)，說(shuō)明使用抗生素尤其是長(zhǎng)期使用后早產(chǎn)兒腸道定植更多的兼性厭氧菌，嚴(yán)格厭氧菌定植延遲。兩組差異菌比較顯示，G1組中的β-變形菌綱、叢毛單菌科、皮桿菌科、黃體桿菌屬和韋榮球菌屬顯著高于G2組。韋榮球菌屬是乳酸發(fā)酵菌，先前的一些研究已報(bào)道了其是成人和嬰兒重要的腸道定植菌[16]，提示長(zhǎng)期使用廣譜抗生素導(dǎo)致早產(chǎn)兒腸道正常菌群的定植明顯延遲，達(dá)優(yōu)勢(shì)化時(shí)間也明顯延遲。

本研究留取早產(chǎn)兒出生后28 d的糞便樣本，結(jié)果表明早期長(zhǎng)時(shí)間廣譜抗生素尤其是第三代頭孢菌素對(duì)早產(chǎn)兒腸道菌群的影響至少可持續(xù)到出生后28 d，其主要的影響以雙歧桿菌、乳酸菌、革蘭陰性桿菌為主。與長(zhǎng)期使用抗生素對(duì)早產(chǎn)兒微生物組成的影響持續(xù)了整個(gè)出生后的前6周[17]結(jié)果一致。

綜上所述，經(jīng)驗(yàn)性、長(zhǎng)期應(yīng)用廣譜抗生素可能會(huì)導(dǎo)致早產(chǎn)兒腸道菌群定植的模式及數(shù)量發(fā)生較長(zhǎng)期的異常改變，應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待早產(chǎn)兒的廣譜抗生素治療，并且必須盡一切努力將治療時(shí)間限制在最短。由于本研究分析的病例數(shù)較少，均為使用抗生素的病例，且無(wú)動(dòng)態(tài)觀察抗生素對(duì)早產(chǎn)兒腸道菌群的影響，還需要更多的病例及樣本來(lái)驗(yàn)證這些結(jié)果。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)新生兒學(xué)組，中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)新生兒科醫(yī)師分會(huì)感染專業(yè)委員會(huì).新生兒敗血癥診斷及治療專家共識(shí)（2019版）[J].中華兒科雜志，2019，57（4）：252-257.

[2]Joseph B，Cantey MD，Alaina K，et al.Early antibiotic exposure and adverse outcomes in preterm very low birth weight infants[J].J Pediatrics，2018，203（12）：62-67.

[3]Bolger AM，Lohse M，Usadel B.Trimmomatic：a flexible trimmer for lllumina sequence data[J].Bioinformatics，2014，30（15）：2114-2120.

[4]Magoc T，Saizberg SL.FLASH：fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies[J].Bioinformatics，2011，27（21）：2957-2963.

[5]Schloss PD，Westcott SL，Ryabin T，et al.Introducing mother：open-source，platform-independent，community-supported software for describing and comparing microbial communities[J].Appl Environ Microbiol，2009，75（23）：7537-7541.

[6]Edgar RC.Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST[J].Bioinformatics，2010，26（19）：2460-2461.

[7]Caporaso JG，Kuczynski J，Stombaugh J，et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J].Nat Methods，2010，7（5）：335-336.

[8]Chernikova DA，Madan JC，Housman ML，et al.The premature infant gut microbiome during the first 6 weeks of life differs based on gestational maturity at birth[J].Pediatr Res，2018，84（1）：71-79.

[9]Berrington JE，Hearn RI，Bythell M，et al.Deaths in preterm infants：changing pathology over 2 decades[J].J pediatr，2012，160（1）：49-53.

[10]Grishin A，Papillon S，Bell B，et al.The role of the intestinal microbiota in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis[J].Semin pediatr Surg，2013，22（2）：69-75.

[11]Groer MW，Luciano AA，Dishaw LJ，et al.Development of the preterm infant gut microbiome：a research priority[J].Microbiome，2014，2：38.

[12]Claud EC，Keegan KP，Brulc JM，et al.Bacterial community structure and functional contributions to emergence of health or necrotizing enterocolitis in preterm infants[J].Microbiome，2013，1（1）：20.

[13]Mohan P，Julia C，Phillip IT，et al.Intestinal dysbiosis in preterm infants preceding necrotizing enterocolitis：a systematic review and meta-analysis[J].Microbiome，2017，5（1）：31.

[14]唐小麗，余加林，艾青，等.腸道菌群多樣性在喂養(yǎng)不耐受新生兒中的作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36（20）：2133-2137.

[15]朱丹萍，杜立中，余加林，等.早產(chǎn)兒早期經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用抗生素對(duì)其腸道菌群的近期影響[J].中國(guó)循證兒科雜志，2016，11（1）：26-29.

[16]Rinttila T，Kassinen A，Malinen E，et al.Development of an extensive set of 16S rDNA-targeted primers for quantification of pathogenic and indigenous bacteria in faecal samples by real-time PCR[J].J Appl Microbiol，2004，97（6）：1166-1177.

[17]Zwittink RD，Renes IB，van Lingen RA，et al.Association between duration of intravenous antibiotic administration and early-life microbiota development in late-preterm infants[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2018，37（3）：475-483.

（收稿日期：2020-03-09 ?本文編輯：祁海文）