姜丹 于晶功 孫寒冰

[摘要] 目的 探討胎兒生長(zhǎng)受限（fetal growth restriction，F(xiàn)GR）患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子P53、bax、bcl-2的表達(dá)及意義。 方法 收集2014年3月～2017年6月大連市婦女兒童醫(yī)療中心剖宮產(chǎn)分娩患者的胎盤，其中正常妊娠晚期（對(duì)照組）、FGR（實(shí)驗(yàn)組）各50例。應(yīng)用免疫組化S-P法檢測(cè)兩組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子P53、bcl-2、bax的表達(dá)。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組bax蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有顯著性（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組bcl-2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，差異有顯著性（P<0.05）。P53蛋白在正常妊娠晚期、FGR組均未見表達(dá)或僅有個(gè)別細(xì)胞表達(dá)，差異無顯著性（P>0.05）。 結(jié)論 FGR患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡是非P53依賴的凋亡，凋亡相關(guān)因子bax、bcl-2蛋白可能共同介導(dǎo)FGR胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡。

[關(guān)鍵詞] FGR;凋亡;P53;bax;bcl-2

[中圖分類號(hào)] R714.5 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）15-0151-04

Expression of factors P53， bcl-2 and bax related to trophoblast cell apoptosis in FGR placenta

JIANG Dan1 ? YU Jinggong2 ? SUN Hanbing2 ? Liu Yuanyuan1 ? ZOU Na1

1.Department of Pathology， Dalian Municipal Women and Children's Medical Center， Dalian ? 116000， China; 2.Department of Pathology， Dalian Maternity Hospital， Dalian ? 116000， China

[Abstract] Objective To explore the expression and significance of factors P53， bax and bcl-2 related to trophoblast cell apoptosis in patients with fetal growth restriction（FGR） placenta. Methods Placentas of patients who experienced Cesarean section from March 2014 to June 2017 in Dalian Municipal Women and Children's Medical Center were collected， including 50 cases of normal late pregnancy（the control group） and 50 cases of FGR（the experimental group）. Immunohistochemical S-P method was used to detect the expression of factors P53， bcl-2 and bax related to trophoblast cell apoptosis in the two groups of placentas. Results The expression of bax protein in the experimental group was obviously higher than that in the control group， and the difference was significant（P<0.05）. The expression of bcl-2 protein in the experimental group was significantly lower than that in the control group（P<0.05）. P53 protein was not expressed in the normal late pregnancy and FGR groups or was only expressed in a few cells， with no significant difference（P>0.05）. Conclusion Apoptosis of placental trophoblast cells in FGR patients is non-P53-dependent apoptosis， and apoptosis-related factors bax and bcl-2 proteins may jointly mediate apoptosis of FGR placental trophoblast cells.

[Key words] FGR; Apoptosis; P53; Bax; Bcl-2

胎兒生長(zhǎng)受限（fetal growth restriction，F(xiàn)GR）是產(chǎn)科常見并發(fā)癥及嚴(yán)重影響圍產(chǎn)兒預(yù)后甚至死亡的病理妊娠過程，其臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為胎兒的出生體重低于同孕齡胎兒平均體重的第十個(gè)百分位數(shù)或兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。FGR不僅影響胎兒發(fā)育，對(duì)兒童期、青春期等智力、體能等都有遠(yuǎn)期潛在影響。FGR的發(fā)病原因除外母體營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)、胎兒遺傳等相對(duì)明確的病因外，還有約40%的患者發(fā)病病因尚不明確[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，不明原因的FGR發(fā)生與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不徹底有關(guān)[2]，絨毛發(fā)育障礙，侵襲過淺，母體則無法通過胎盤供應(yīng)給胎兒充足的血液及營(yíng)養(yǎng)。在FGR的發(fā)病機(jī)制中，有關(guān)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡異常及凋亡的調(diào)控機(jī)制被廣為關(guān)注。在妊娠期的整個(gè)過程中均存在著胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，任何凋亡狀態(tài)的異常均會(huì)引起胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲障礙，導(dǎo)致FGR病理妊娠的發(fā)生[3]。本課題組經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)FGR胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞存在凋亡增加的現(xiàn)象[4]，現(xiàn)用免疫組化方法檢測(cè)凋亡相關(guān)因子p53、bax、bcl-2的表達(dá)與FGR胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年3月～2017年6月大連市婦女兒童醫(yī)療中心及大連市婦幼保健院住院分娩患者妊娠晚期剖宮產(chǎn)的胎盤，對(duì)照組50例，臨床診斷為FGR的患者胎盤，實(shí)驗(yàn)組50例，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均除外產(chǎn)婦有其他產(chǎn)科或內(nèi)科等并發(fā)癥。產(chǎn)婦均無不良嗜好，無特殊疾病感染病史，非試管嬰兒，產(chǎn)婦年齡25～33歲，平均（30.3±2.5）歲，孕周35～40周，平均（36.8±2.3）周。所有選取的產(chǎn)婦均為單胎剖宮產(chǎn)，自然受孕，產(chǎn)兒均為活胎，Apgar評(píng)分8～10分。兩組產(chǎn)婦的年齡、孕周等臨床資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。送檢胎盤的取材均為臨床常規(guī)正常送檢胎盤，經(jīng)產(chǎn)婦及家屬知情同意。

1.2 主要方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及實(shí)驗(yàn)儀器 ?鼠抗人P53、bax、bcl-2單克隆抗體、DAB染色液、SP免疫組化試劑盒等均購(gòu)自基因科技（上海）有限公司。全自動(dòng)組織切片機(jī)LeicaRM2255，全自動(dòng)組織脫水機(jī)Thermo_Excelsior_ES，全自動(dòng)免疫組化儀Roche Benchmark XT，olympus顯微鏡BX41。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 ?送檢胎盤，選取胎盤母體面中央?yún)^(qū)，避開邊緣區(qū)，出血、鈣化、機(jī)化、血栓等區(qū)取材，0.9%氯化鈉注射液沖洗三次，10%福爾馬林固定36 h，常規(guī)石蠟包埋、組織切片、HE染色、免疫組化SP染色。

免疫組化SP法檢測(cè)P53、bax、bcl-2蛋白在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)：參考基因科技P53、bax、bcl-2免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒說明書，組織切片按病理學(xué)常規(guī)脫蠟，水化，抗原熱修復(fù)，PBS沖洗，過氧化物酶孵育12 min，加一抗，37℃水育60 min，PBS沖洗3次，每次10 min，加二抗37℃水育30 min，PBS沖洗3次，每次10 min，顯微鏡下根據(jù)染色實(shí)際情況而定，DAB顯色5～10 min終止顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化染色表達(dá)強(qiáng)度并拍照。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定方法 ?免疫組化半定量結(jié)果判讀：光學(xué)顯微鏡下采用組織標(biāo)本滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞漿中有淺黃色至棕褐色顆粒沉積為陽性的判讀標(biāo)準(zhǔn)。每張免疫組化染色切片隨機(jī)選取15個(gè)高倍（×400）視野，按每張切片滋養(yǎng)細(xì)胞陽性細(xì)胞著色的百分比例以及著色的強(qiáng)度深淺進(jìn)行半定量分析。陽性細(xì)胞著色百分比率記A：<5%，0分;5%～25%，1分;26%～50%，2分;>50%，3分;陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度記B：無染色或只有淡黃的背景染色，0分;淡黃色細(xì)胞膜或細(xì)胞漿染色，1分;黃色細(xì)胞膜或細(xì)胞漿染色，2分;棕褐色細(xì)胞膜或細(xì)胞漿染色，3分。積分=A×B。積分0分（-）;積分1～3分（+）;積分4～6分（++）;積分7～9分（+++）。每組實(shí)驗(yàn)均由兩位病理主治以上診斷醫(yī)生顯微鏡下判讀，最后取檢測(cè)結(jié)果的平均值作為最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)等級(jí)資料的性質(zhì)進(jìn)行適合的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[5-6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凋亡相關(guān)因子P53在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)

P53蛋白主要表達(dá)于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞核，本實(shí)驗(yàn)中P53在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中僅見極少量的斑駁表達(dá)或不表達(dá)，表達(dá)沒有顯著差異（P>0.05），見表1，封三圖11A、11B。

2.2 bax、bcl-2在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)

bax、bcl-2在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中均見表達(dá)，最主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中以及細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞漿中或表達(dá)于蛻膜組織中。實(shí)驗(yàn)組中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞bax的表達(dá)明顯高于對(duì)照組滋養(yǎng)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1、封三圖12A、12B。實(shí)驗(yàn)組bcl-2蛋白在滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1、封三圖13A、13B。

3 討論

FGR是產(chǎn)科常見并發(fā)癥，其病因多而復(fù)雜，目前尚有一部分的FGR病因不明確。FGR不僅會(huì)引起嚴(yán)重的圍產(chǎn)期并發(fā)癥，對(duì)產(chǎn)婦造成重要影響，從長(zhǎng)遠(yuǎn)的意義看還可能會(huì)造成兒童智力的發(fā)育及心理健康重大影響。胎盤組織是介于胎兒和產(chǎn)婦之間的物質(zhì)交換重要器官，胎盤的異?？赡軐?dǎo)致胎盤血液灌注不足，與之相連的是胎兒無法得到充足的營(yíng)養(yǎng)供給，引起FGR的發(fā)生。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，從分子學(xué)機(jī)制對(duì)FGR的發(fā)生發(fā)展有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。有研究指出FGR的胎盤中存在凋亡基因[7]。細(xì)胞的凋亡是活體組織發(fā)生的程序性的細(xì)胞死亡，正常病理生理過程及個(gè)體成熟發(fā)育都必不可少的一種分子生物學(xué)現(xiàn)象[8]。本實(shí)驗(yàn)組前期研究發(fā)現(xiàn)FGR胎盤存在凋亡增加，可能導(dǎo)致胎盤正常功能失衡引起FGR。細(xì)胞凋亡是多因素的共同調(diào)節(jié)使細(xì)胞凋亡得以程序性的進(jìn)行，維持機(jī)體的正常功能[9]。影響FGR胎盤凋亡的相關(guān)調(diào)控因子主要有哪些是本實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)，這些凋亡因子在FGR胎盤凋亡發(fā)生中有什么影響，值得我們進(jìn)一步深入探討和研究。

Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡中起著重要作用，是一類新的癌基因家族[10]，分為二類，其一主要功能是抑制凋亡，代表基因?yàn)閎cl-2，它的生理功能是抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，而不影響細(xì)胞的周期和分化[11]。另一類主要功能為促進(jìn)細(xì)胞凋亡，代表基因?yàn)閎ax，bax可以自身形成同源二聚體或與bcl-2形成異源二聚體，共同參與細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞凋亡的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[12]。Bcl-2和bax蛋白在細(xì)胞凋亡中的作用相反，通常是以二聚體形式保持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡發(fā)揮正常作用，當(dāng)兩組蛋白表達(dá)失衡，會(huì)形成同源二聚體如bax/bax同源二聚體，或bcl-2/bcl-2同源二聚體，bax/bax同源二聚體數(shù)量增多導(dǎo)致細(xì)胞過度凋亡，影響組織正常生理功能，bcl-2/bcl-2同源二聚體數(shù)量增多，抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致正常凋亡失衡，同樣也可以引起組織功能異常。有研究表明，Bcl-2胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞中低表達(dá)，而在合體滋養(yǎng)細(xì)胞中高表達(dá)，在妊娠的早、中、晚期表達(dá)也不一樣[13]。在正常妊娠過程中，凋亡持續(xù)存在，妊娠早期以抑制細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞增殖為主，妊娠晚期以細(xì)胞凋亡增加為主，在這個(gè)過程中凋亡因子發(fā)生著變化維持胎盤的動(dòng)態(tài)平衡，參與細(xì)胞凋亡的過程。經(jīng)本課題組研究證實(shí)，在正常妊娠晚期（對(duì)照組）、FGR患者胎盤（實(shí)驗(yàn)組）均可見滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)GR（實(shí)驗(yàn)組）滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡明顯增加。Bcl-2和bax蛋白在FGR發(fā)生異常凋亡中是否起著一定的作用，如果有作用，它們是如何調(diào)控FGR胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞高凋亡現(xiàn)象是本實(shí)驗(yàn)關(guān)注的主要問題。