孫曉萌，齊義軍，高社干

1)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院 河南洛陽 471003 2)河南省腫瘤表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南洛陽 471003

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第7位和第6位[1]。組織學(xué)上，約88%的食管癌為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[2]。由于ESCC早期癥狀不典型，約80%的ESCC患者就診時已發(fā)展到臨床晚期，5 a生存率僅為10%～15%[3]。目前，姑息性放化療是晚期ESCC的主要治療方案，然而療效并不理想，亟須篩查ESCC特異性靶向藥物。鱗狀細(xì)胞癌擴(kuò)增基因1(gene amplified in squamous cell carcinoma 1, GASC1)是第一個從ESCC細(xì)胞系擴(kuò)增識別的癌基因[4]。GASC1高表達(dá)于ESCC干細(xì)胞ALDHbri+亞群，并與ESCC低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期差等惡性腫瘤特征密切相關(guān)[5-6]。Cheung等[7]篩選了640個自然產(chǎn)物文庫，發(fā)現(xiàn)咖啡酸是有效的GASC1抑制劑之一?？Х人崾怯袡C(jī)酸中的酚酸類物質(zhì)之一，廣泛存在于多種食物以及中草藥中[8]?？Х人岵粌H具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等功能，而且還有抗腫瘤作用[9-10]。本研究探討了GASC1抑制劑咖啡酸對ESCC細(xì)胞KYSE150增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力以及裸鼠移植瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1材料15只6～8周齡雄性裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物墊料、飼料購自舒克貝塔公司。KYSE150細(xì)胞由河南省腫瘤表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI 1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、青鏈霉素混合液購自索萊寶公司。咖啡酸購自MCE公司，純度≥98%，以DMSO配制為儲存液，-20 ℃保存。CCK-8試劑盒購自日本東仁化學(xué)科技有限公司(上海)，DMSO購自Sigma公司，含有基質(zhì)膠和不含基質(zhì)膠的Transwell小室分別購自Corning公司、BD公司。倒置顯微鏡購自Nikon公司，全自動酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)KYSE150細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，至80%融合時傳代或凍存。

1.3不同濃度咖啡酸對細(xì)胞增殖能力的影響取對數(shù)生長期的KYSE150細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個/mL，按100 μL/孔接種于96孔板。用5、10、20、50 μmol/L的咖啡酸分別處理KYSE150細(xì)胞，對照組細(xì)胞以DMSO處理，每組設(shè)置3個平行孔，并設(shè)置只含培養(yǎng)基的空白調(diào)零孔。于處理后12、24、48、72、96 h，每孔加入10 μL CCK-8，避光混勻后置于培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4咖啡酸處理后細(xì)胞遷移、侵襲能力檢測用20 μmol/L咖啡酸處理細(xì)胞96 h后，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，加無血清培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，將300 μL含7.5×104個細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種于不含基質(zhì)膠的Transwell小室上室或?qū)?00 μL含1×105個細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種于含有基質(zhì)膠的小室上室，小室下室均加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基750 μL，置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、36 h，取出小室，結(jié)晶紫染色，棉簽擦除小室上層細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察，選取5個視野(×100)，計(jì)數(shù)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5咖啡酸處理后裸鼠移植瘤體積和質(zhì)量的檢測收集處于對數(shù)生長期、熒光素酶標(biāo)記的KYSE150細(xì)胞(Luc-KYSE150細(xì)胞)，于裸鼠肩背部皮下接種100 μL PBS重懸的Luc-KYSE150細(xì)胞約3×106個。2周后觀察皮下成瘤情況，然后隨機(jī)分為3組：對照組、低濃度咖啡酸組和高濃度咖啡酸組(咖啡酸濃度參照文獻(xiàn)[11])，每組5只，分別給予100 μL質(zhì)量濃度為3 g/L的羥甲基纖維素鈉、以3 g/L羥甲基纖維素鈉溶解的咖啡酸50 mg/kg或100 mg/kg腹腔注射，1次/d，共4周。期間每周測量瘤體大小，計(jì)算腫瘤體積(V=ab2/2，其中a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑)。4 周后用小動物成像儀進(jìn)行皮下瘤成像，然后脫頸處死裸鼠，剝離皮下瘤，稱取質(zhì)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 24.0處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用5×5析因設(shè)計(jì)的方差分析評估不同濃度的咖啡酸處理不同時間對KYSE150細(xì)胞增殖的影響，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較對照組和咖啡酸組KYSE150細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)的差異，應(yīng)用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較對照組、低濃度咖啡酸組和高濃度咖啡酸組裸鼠腫瘤體積的差異，應(yīng)用單因素方差分析比較接種4周后對照組、低濃度咖啡酸組和高濃度咖啡酸組裸鼠腫瘤質(zhì)量的差異，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1咖啡酸對KYSE150細(xì)胞增殖的影響不同濃度咖啡酸均能抑制KYSE150細(xì)胞的增殖，且隨著藥物濃度增加，抑制作用增強(qiáng)，50 μmol/L咖啡酸幾乎導(dǎo)致KYSE150細(xì)胞增殖停滯(表1)。

表1 咖啡酸對KYSE150細(xì)胞增殖的影響(n=3)

2.2咖啡酸對KYSE150細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響20 μmol/L咖啡酸處理KYSE150細(xì)胞96 h后，侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)減少(表2)。

表2 咖啡酸對KYSE150細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

2.3咖啡酸對裸鼠皮下移植瘤生長的影響隨著濃度的增加，咖啡酸的抑瘤作用增強(qiáng)(表3)；此外，低、高濃度咖啡酸組裸鼠皮下腫瘤質(zhì)量分別為(0.45±0.07) g和(0.38±0.07) g，均低于對照組[(0.55±0.07) g],且高濃度咖啡酸組更低(F=8.443,P=0.005)。

表3 3組裸鼠皮下腫瘤體積比較 mm3

3 討論

食管癌是發(fā)生于食管黏膜上皮組織的一種常見的消化道惡性腫瘤，隨著環(huán)境、飲食、生活習(xí)慣等多種易感因素的變化，以及人口基數(shù)和老齡化趨勢，ESCC的發(fā)病人數(shù)逐漸增加。最新一次中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[9]顯示ESCC發(fā)病率及病死率在我國惡性腫瘤中分別居第3位和第4位。ESCC早期癥狀不明顯，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已進(jìn)展為晚期，失去了根治性手術(shù)的機(jī)會，姑息性同步放化療的效果有限，尤其重要的是，目前缺乏ESCC特異性靶向治療藥物。

GASC1定位于9p23-24，是組蛋白賴氨酸去甲基化酶4(histone lysine demethylases 4, KDM4)家族成員之一，又稱KDM4C、JMJD2C[4]。GASC1編碼的核蛋白具有Jumonji C結(jié)構(gòu)域，能夠催化組蛋白第9位和第36位賴氨酸(H3K9、H3K36)去甲基化來調(diào)控甲基化水平[10-13]，進(jìn)而參與影響腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化。腫瘤干細(xì)胞或者腫瘤起始細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、放化療抵抗及復(fù)發(fā)的起源細(xì)胞，屬于腫瘤細(xì)胞群體中具有特殊生物學(xué)功能的細(xì)胞亞群[14-16]，具有自我更新、多向分化、惡性增殖、腫瘤重建等生物學(xué)特性。我們課題組已篩選出ALDHbri+ESCC腫瘤干細(xì)胞亞群，并發(fā)現(xiàn)該亞群GASC1高表達(dá)，敲除GASC1后ALDHbri+ESCC亞群細(xì)胞惡性增殖、自我更新、體內(nèi)成瘤等干細(xì)胞生物學(xué)特性均受到抑制，表明GASC1參與ESCC腫瘤干性的維持[6]。此外，作者所在課題組又通過免疫組化的方法檢測了82例確診為原發(fā)性ESCC的患者標(biāo)本，結(jié)果顯示ESCC組織中GASC1高表達(dá)與ESCC患者低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期差等臨床病理學(xué)特征呈正相關(guān)[5]。因此，推斷GASC1是潛在的食管癌分子治療靶點(diǎn)。

咖啡酸存在于食物及中草藥中[8]，咖啡酸的藥理作用有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等，還能夠發(fā)揮升白細(xì)胞、血小板及止血等作用[17-18]。近期研究[19-22]發(fā)現(xiàn)，咖啡酸及其衍生物咖啡酸苯乙酯具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，咖啡酸能夠呈濃度依賴性抑制ESCC細(xì)胞KYSE150的生長；20 μmol/L咖啡酸可抑制KYSE150細(xì)胞遷移、侵襲能力。裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，與對照組相比，高、低濃度咖啡酸組裸鼠皮下腫瘤體積減小，質(zhì)量降低，證實(shí)了咖啡酸對ESCC細(xì)胞具有抗腫瘤作用。

綜上所述，咖啡酸能夠抑制ESCC細(xì)胞KYSE150增殖、遷移、侵襲及裸鼠皮下移植瘤生長等惡性生物學(xué)行為，為咖啡酸的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。