沈暉，鄔靖敏，寧興旺，李軍，王斌，陳東科(.長沙市第一醫(yī)院檢驗科，長沙 0005；.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，長沙 0007；.中南大學湘雅醫(yī)院檢驗科，長沙 0008；.北京醫(yī)院檢驗科，北京 0000)

諾卡菌對培養(yǎng)基無特殊選擇性，血瓊脂、巧克力瓊脂、緩沖活性炭酵母提取物瓊脂等均可用于分離培養(yǎng)。為了提高諾卡菌的檢出率，來自呼吸道含有諾卡菌的標本，可采用低pH(pH2.2)的HCl/KCl溶液進行預處理，亦可同分枝桿菌(Mycobacterium)培養(yǎng)方法用氫氧化鈉-N-乙酰-L-半胱氨酸(NaOH-NALC)預處理標本。而提高諾卡菌屬細菌培養(yǎng)陽性率的關(guān)鍵是掌握NaOH-NALC試劑暴露時間(15 min)，這同樣適用于分枝桿菌分離培養(yǎng)[1]。本研究擬探討分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)應用于諾卡菌分離的可行性。

1 材料與方法

1.1標本來源 2018年1月至2019年4月長沙市第一醫(yī)院住院及門診患者中臨床疑似肺結(jié)核或肺部感染性疾病并按醫(yī)囑采集自然咳出晨痰或支氣管肺泡灌洗液進行分枝桿菌培養(yǎng)的標本6 592份。標本來源分布為呼吸科2 387份、結(jié)核科2 385份、艾滋病科965份、心內(nèi)科13份、內(nèi)分泌科19份、血液腫瘤科16份、其他科室807份。

1.2主要試劑與儀器 NaOH、枸櫞酸鈉、磷酸鹽緩沖液(天津恒興化學試劑公司)，N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC,BIOTAL公司)，哥倫比亞血培養(yǎng)基、羅氏固體培養(yǎng)基(江門凱林公司)，萋-尼氏抗酸染色液(珠海貝索公司)；Bact/ALERT 3D全自動分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)及分枝桿菌培養(yǎng)瓶(MP培養(yǎng)瓶)、分枝桿菌抗生素補充檢測試劑盒、Vitek MS質(zhì)譜儀及Vitek MS分枝桿菌/諾卡菌試劑盒(法國生物梅里埃公司)，BSC-1500 ⅡB2-X生物安全柜、QP-80恒溫培養(yǎng)箱(濟南鑫貝西生物公司)，Veriti 9902 PCR擴增儀、3730XL基因測序儀(ABI公司)，LEICA DM3000顯微鏡(德國萊卡公司)。

1.3分離培養(yǎng)前處理 分枝桿菌培養(yǎng)前處理操作參照《結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)培訓教程》[2]。NaOH-NALC前處理液配制：40 g/L NaOH溶液、29 g/L枸櫞酸鈉溶液等體積混勻并滅菌，用時按5 g/L濃度加入NALC，滅菌備用。將痰液、支氣管肺泡灌洗液標本約5 mL置50 mL離心試管中，加等量的前處理液漩渦震蕩1 min，靜置15 min后加入無菌磷酸鹽緩沖液(pH6.8)至50 mL，3 000×g15 min，去上清液并添加1 mL無菌磷酸鹽緩沖液(pH6.8)以中和pH至6.8；MP培養(yǎng)瓶樣本中加入0.5 mL分枝桿菌抗生素補充液，將消化后標本0.5 mL用一次性無菌注射器接種于MP培養(yǎng)瓶；放入Bact/ALERT 3D全自動分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)進行培養(yǎng)。前處理過程中去污染不徹底會發(fā)生污染，常見的污染菌包括真菌、細菌、放線菌(戈登菌和鏈霉菌)等，納入污染標本統(tǒng)計。

1.4培養(yǎng)及鑒定 MP培養(yǎng)瓶陽性報警后取出并在生物安全柜中操作。取正常人血漿1滴于玻片中央，無菌注射器抽取培養(yǎng)液接種羅氏固體培養(yǎng)基并取數(shù)滴培養(yǎng)液與血漿混合涂片，置于80 ℃干燥箱中干燥，進行抗酸染色與弱抗酸染色鏡檢。培養(yǎng)陽性標本中諾卡菌形態(tài)學識別參照《臨床微生物學手冊》[1]：當發(fā)現(xiàn)具有抗酸性或弱抗酸性、長而纖細、分枝明顯的菌絲或小串珠樣短桿菌，再用無菌注射器抽取培養(yǎng)液接種血瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)，數(shù)天后再次分純培養(yǎng)。分純后菌落用Vitek質(zhì)譜儀進行鑒定，具體操作參照儀器說明書進行；對未成功鑒定菌株進行16S rRNA基因擴增與測序鑒定，引物序列為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，目的片段約1 500 bp，引物合成和測序委托北京睿博興科公司。反應體系25 μL：Premix EX Taq 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR擴增參數(shù)為94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 72 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR擴增產(chǎn)物用酒精純化后加入高度去離子甲酰胺混勻，再轉(zhuǎn)至ABI 3730XL基因測序儀進行Sanger雙向測序，結(jié)果在PubMed上進行BLAST分析。

2 結(jié)果

2.1諾卡菌分離 MP培養(yǎng)陽性瓶經(jīng)萋-尼氏抗酸染色、鏡檢，分枝桿菌呈抗酸性細桿狀、稍彎曲、排列致密，并接種羅氏固體培養(yǎng)基分離、鑒定；諾卡菌經(jīng)萋-尼氏抗酸染色可部分顯示抗酸性或完全失去抗酸性，但長而纖細、排列疏松的分枝菌絲或串珠樣排列的短桿菌特征明顯，再采用弱抗酸染色重新鏡檢識別，并接種血瓊脂和羅氏固體培養(yǎng)基分離、鑒定。見圖1、圖2。6 592份呼吸道標本檢出分枝桿菌998份，陽性率為15.14%；諾卡菌58份，陽性率為0.88%；檢出其他污染菌264份，污染率4.02%。

2.2諾卡菌鑒定 剔除重復送檢分離菌株，51株諾卡菌中采用VITEK MS質(zhì)譜鑒定48株，另3株質(zhì)譜未獲鑒定菌株經(jīng)16S rRNA基因擴增與測序技術(shù)獲得鑒定(分別為皮疽諾卡菌2株和新星諾卡菌1株)。菌種分布為皮疽諾卡菌44株、新星諾卡菌2株、蓋爾森基興諾卡菌2株、星形諾卡菌1株、豚鼠耳炎諾卡菌1株和非洲諾卡菌1株。

2.3諾卡菌檢出患者資料 諾卡菌陽性標本包括痰液45份、支氣管肺泡灌洗液6份；科室分布為呼吸科26株、結(jié)核科18株、艾滋病科4株和其他科室3株?；颊咂骄挲g66.2歲，其中男性33人、女性18人。送檢科室與諾卡菌菌種分布見表1。

表1 51株諾卡菌菌種與科室分布(n)

3 討論

諾卡菌生長緩慢，而呼吸道標本中又常定植有大量非致病性或條件致病性微生物，因此造成常規(guī)呼吸道樣本培養(yǎng)時諾卡菌的檢出率較低。分枝桿菌培養(yǎng)時用NaOH-NALC預處理標本，可盡可能地清除無關(guān)微生物的干擾，在MP培養(yǎng)瓶中添加的分枝桿菌抗生素補充檢測試劑(萬古霉素、兩性霉素、多黏菌素B)等抗菌藥物可進一步地抑制雜菌生長。分枝桿菌培養(yǎng)體系中分離諾卡菌的關(guān)鍵是NaOH-NALC消化時間與培養(yǎng)陽性標本的正確染色、識別。Murray等[3]報道，將諾卡菌暴露于NaOH-NALC 30 min后，其活力降低，因此控制消化時間(15 min)可同時兼顧分枝桿菌與諾卡菌培養(yǎng)；培養(yǎng)陽性標本僅采用金胺O分枝桿菌熒光染色，諾卡菌形態(tài)學認識的缺乏會導致諾卡菌的漏檢。諾卡菌弱抗酸染色可見抗酸性長而纖細、分枝明顯菌絲，也可見抗酸性小串珠樣不緊密相鄰的球桿菌(見圖1)，但采用萋-尼氏抗酸染色可部分顯示抗酸性或失去抗酸性(見圖2)。另將諾卡菌接種羅氏斜面培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)約5.88%(3/51)的諾卡菌不能生長，因此諾卡菌培養(yǎng)需接種合適的培養(yǎng)基。

雖然MP培養(yǎng)瓶中加入了微量甲氧芐胺嘧啶，但是對2份(蓋爾森基興諾卡菌、豚鼠耳炎諾卡菌)支氣管肺泡灌洗液抗酸染色提示諾卡菌標本的追蹤，分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)均成功分離到諾卡菌，儀器報陽時間分別為6 d、10 d，甲氧芐胺嘧啶對諾卡菌培養(yǎng)陽性率的影響有待進一步研究。1例抗酸染色提示諾卡菌病例，多次培養(yǎng)未分離到諾卡菌，該患者在留取標本前已確診肺諾卡菌病，并持續(xù)服用治療劑量復方磺胺甲噁唑，推測可能由于諾卡菌蛋白質(zhì)合成受阻、菌株活性降低，不能耐受NaOH-NALC的消化處理；而采用血瓊脂培養(yǎng)及延長培養(yǎng)時間，仍可分離到諾卡菌。相同時間段采用直接接種血瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)時僅分離到5株諾卡菌，而分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)能分離多達51株諾卡菌(報陽時間3～14 d，平均7.18 d)。由此可見，作為臨床微生物檢驗技術(shù)中常使用的瓊脂培養(yǎng)基分區(qū)劃線、分離培養(yǎng)的補充，采用NaOH-NALC預處理呼吸道標本的Bact/ALERT 3D全自動分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)可顯著提高呼吸道標本中諾卡菌培養(yǎng)的陽性率。

連璐璐等[4]報道呼吸道標本中分離的31株諾卡菌中包括皮疽諾卡菌30株和卡爾涅亞諾卡菌(N.carnea)1株，分離菌種分布與本文結(jié)果相似。本研究皮疽諾卡菌的檢出率(86.28%)高于泰國(35%)[5]和比利時(44%)[6]的報道，可能與地區(qū)差異有關(guān)。大多數(shù)諾卡菌菌種對絕大部分商品化生化試劑無反應，在種水平的鑒定需依賴基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)或16S rRNA基因序列分析。本文采用VITEK質(zhì)譜儀成功鑒定了51株諾卡菌中的48株(94.1%)，其余3株(皮疽諾卡菌2株、新星諾卡菌1株)無鑒定結(jié)果；推測與涂抹菌量、菌株新鮮程度有關(guān)，菌株生長緩慢(VITEK質(zhì)譜分析要求孵育時間24～72 h)、嵌入瓊脂較深不易挑取會導致菌體蛋白質(zhì)的量不足，從而造成鑒定失敗。

痰中分離到諾卡菌可能為定植、一過性感染或污染。免疫抑制患者或宿主防御缺陷的患者中痰培養(yǎng)諾卡菌陽性通常認定為感染，免疫正?；颊咛抵蟹蛛x到諾卡菌但無明顯感染癥狀時應密切隨訪[7]。在商品化諾卡菌選擇性培養(yǎng)系統(tǒng)出現(xiàn)以前，采用NaOH-NALC去污染的Bact/ALERT 3D全自動分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)雖有所欠缺，但可顯著提高呼吸道標本中諾卡菌培養(yǎng)的陽性率。