李洋，姚立瓊，劉志武，梁帥龍，韋小寶，劉旭升，頡曉玲(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院a.檢驗科，b.中心實驗室，蘭州730000；.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000)

艱難梭菌(Clostridiumdifficile)是一種革蘭陽性厭氧芽胞桿菌，可引起腹瀉、偽膜性腸炎、中毒性巨結(jié)腸甚至敗血癥等嚴(yán)重臨床感染。艱難梭菌毒素A(TcdA)和毒素B(TcdB)是該菌的主要致病因素[1]。在歐美國家，艱難梭菌的流行已成為影響公共衛(wèi)生的一大挑戰(zhàn)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[2]。艱難梭菌流行病學(xué)研究可采用PCR核糖體分型(PCR-ribotyping)、脈沖場凝膠電泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE)、多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)及序列測定等方法。核糖體分型是歐洲艱難梭菌參比實驗室分型標(biāo)準(zhǔn)方法，實驗條件要求低，經(jīng)濟實用，可快速判斷艱難梭菌是否暴發(fā)流行。在北美及歐洲地區(qū)多次暴發(fā)流行的核糖體分型027型產(chǎn)毒型艱難梭菌[3]，近年來在國內(nèi)也有報道[4]。本研究旨在了解本院腹瀉患者艱難梭菌感染現(xiàn)狀，明確艱難梭菌產(chǎn)毒情況，同時對分離菌株進(jìn)行核糖體分型，探討菌株流行病學(xué)特點。

1 材料及方法

1.1標(biāo)本收集 收集2019年5月至10月蘭州大學(xué)第一醫(yī)院161例住院腹瀉患者(腹瀉次數(shù)≥3次/d)的糞便標(biāo)本，其中男性102份，女性59份。

1.2主要儀器與試劑 S1000型PCR擴增儀、Gel Doc XR凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，Vitek MS基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(法國生物梅里埃公司)；艱難梭菌選擇培養(yǎng)基(chromIDTMC.difficileagar，CDIF)、哥倫比亞血瓊脂平板、厭氧產(chǎn)氣袋(法國生物梅里埃公司)，糞便細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技公司)，Premix Taq酶、100 bp DNA ladder marker(TaKaRa公司)；引物由南京金斯瑞公司合成；艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 43255和ATCC BAA-1870由江蘇省人民醫(yī)院劉根焰教授惠贈。

1.3細(xì)菌DNA提取及毒素基因檢測 用糞便細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取糞便細(xì)菌基因組DNA，依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。參照文獻(xiàn)中方法[5]用PCR法檢測毒素A基因(tcdA)和毒素B基因(tcdB)。引物序列見表1。反應(yīng)體系共25 μL：Premix Taq緩沖液12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳成像觀察。

表1 艱難梭菌毒素基因檢測及核糖體分型引物

1.4艱難梭菌產(chǎn)毒培養(yǎng)法 糞便標(biāo)本收集后立即接種于CDIF及哥倫比亞血平板，35 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。選取CDIF上黑色、扁平、邊緣不規(guī)則、具有特殊臭味的典型菌落，用Vitek MS系統(tǒng)鑒定。培養(yǎng)陽性菌株進(jìn)行tcdA、tcdB檢測，同1.3。

1.5核糖體分型 參照Bidet等研究[6]，用PCR法擴增16S～23S rRNA基因間隔區(qū)(ITS)，進(jìn)行菌株分型，引物序列見表1。反應(yīng)體系共50 μL：Premix Taq緩沖液25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各5 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 12 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；75 ℃ 45 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)30 g/L瓊脂糖凝膠電泳成像觀察。以ATCC 43255和ATCC BAA-1870(核糖體027型)作為對照菌株。菌株核糖體分型結(jié)果聚類分析采用軟件BioNumerics BN7.5cn，相似系數(shù)采用Dice算法，位置差異容許度為1.5%，聚類算法選擇非加權(quán)組平均法(UPGMA)。相似度100%認(rèn)定為同一核糖體帶型。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 26.0軟件進(jìn)行。艱難梭菌產(chǎn)毒培養(yǎng)法及糞便毒素基因檢測結(jié)果進(jìn)行配對χ2檢驗和Kappa一致性檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Kappa系數(shù)≥0.75，認(rèn)為2種方法診斷結(jié)果一致性較好；Kappa值<0.4，認(rèn)為2種方法診斷結(jié)果不一致。

2 結(jié)果

2.1產(chǎn)毒株的篩查 161份糞便標(biāo)本直接艱難梭菌毒素基因檢測陽性率9.94%(16/161)；經(jīng)培養(yǎng)鑒定獲得18株艱難梭菌，經(jīng)毒素分子檢測，其中16株檢出毒素基因，分別為tcdA+tcdB+15株(83.33%)，tcdA-tcdB+1株(5.56%)。見圖1。配對χ2檢驗結(jié)果顯示艱難梭菌產(chǎn)毒培養(yǎng)法與糞便毒素基因檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，2種方法診斷結(jié)果一致性較好(Kappa=0.931)。見表2。

表2 糞便毒素基因檢測與產(chǎn)毒培養(yǎng)法結(jié)果比較

2.2菌株核糖體分型 對分離所得18株艱難梭菌進(jìn)行核糖體分型，共有16種型別，命名為GS1～GS16，均為不同科室散發(fā)，未見聚集暴發(fā)病例，未發(fā)現(xiàn)027型菌株，見圖2。

3 討論

本研究中住院腹瀉患者糞便艱難梭菌毒素基因陽性率為9.94%，接近國內(nèi)其他地區(qū)類似研究[7]，應(yīng)引起本地區(qū)臨床及感染控制相關(guān)部門注意。

艱難梭菌為專性厭氧菌，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定困難且耗時，但厭氧培養(yǎng)敏感性高，菌株可用于流行病學(xué)調(diào)查[8]。本研究選擇CDIF顯色培養(yǎng)基選擇分離出可疑菌落，再結(jié)合VITEK MS快速、準(zhǔn)確作出鑒定。TcdA和TcdB是艱難梭菌的主要毒力因子，目前有多種商品化檢測系統(tǒng)用于毒素基因檢測，但需要特定儀器，試劑成本較高。本研究糞便標(biāo)本基因組提取后PCR檢測A、B毒素基因，耗時短，成本低，易于開展。產(chǎn)毒培養(yǎng)法是艱難梭菌診斷的參考方法，用來評價其他檢測方法。本研究中糞便毒素基因檢測結(jié)果與產(chǎn)毒培養(yǎng)法比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，一致性較好，表明糞便毒素基因檢測方法可獨立用于檢測產(chǎn)毒素艱難梭菌。同時采用2種方法可互補并增加檢出率，其中1例PCR毒素檢測陰性標(biāo)本培養(yǎng)后毒素檢測為陽性，可能由于此糞便標(biāo)本中艱難梭菌含量較少；而1例A、B毒素陽性標(biāo)本可能由于保存運輸時間較長而未培養(yǎng)到菌株。

培養(yǎng)鑒定所得18株艱難梭菌毒素基因檢測結(jié)果顯示，非產(chǎn)毒株tcdA-tcdB-占11.11%，tcdA+tcdB+產(chǎn)毒株占83.33%，tcdA-tcdB+產(chǎn)毒株占5.56%，表明本地區(qū)艱難梭菌感染中產(chǎn)毒株占優(yōu)勢，同相關(guān)研究結(jié)果一致[9]。

核糖體027型產(chǎn)毒型艱難梭菌曾在多個國家暴發(fā)流行，毒力作用大且易復(fù)發(fā)。近年來，我國內(nèi)地報道027菌株均為散發(fā)[10]，未引起暴發(fā)流行。本研究采用ATCC 43255、ATCC BAA-1870(核糖體027型)作為對照菌株，對18株艱難梭菌進(jìn)行核糖體分型，未發(fā)現(xiàn)027型高毒力菌株，同時也未發(fā)現(xiàn)院內(nèi)聚集暴發(fā)流行。