高嶧涵，鄭賽晶，汪陽(yáng)忠，簡(jiǎn)小朋，楊 菁，沈 軼*

1. 上海新型煙草制品研究院，上海市大連路789 號(hào) 200082

2. 上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海市長(zhǎng)陽(yáng)路717 號(hào) 200082

煙草特有亞硝胺（TSNAs）屬于非揮發(fā)性亞硝胺，主要存在于煙草和煙氣粒相物中［1-2］。TSNAs中有4 種較常見：N-亞硝基降煙堿（NNN）、N-亞硝基新煙草堿（NAT）、N-亞硝基假木賊堿（NAB）和4-（N-甲基亞硝胺基）-1-（3-吡啶基-1-丁酮（NNK），其中NNK 和 NNN 的致癌性較強(qiáng)［3-4］。多年來(lái)，煙草及煙草制品中的TSNAs 一直受到科研人員的關(guān)注，但具有廣泛適用性的降低TSNAs 方法較少。由于煙葉及卷煙煙氣成分復(fù)雜，TSNAs的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差且含量極低，因此選擇性吸附煙草及煙草制品中TSNAs 的難度較大［5-7］。

口含煙近年來(lái)逐漸成為新型煙草制品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。口含煙遞送的煙堿也能夠滿足吸煙者的需求?？诤瑹熤袩煵萏赜衼喯醢返暮枯^低，但由于NNK、NNN 具有致癌性，其安全性同樣受到消費(fèi)者的關(guān)注。全球多個(gè)國(guó)家或機(jī)構(gòu)對(duì)口含煙產(chǎn)品中TSNAs 的含量提出了明確的限量要求。世界衛(wèi)生組織（WHO）和瑞典食品局（Swedish Food Agency）限量要求是：NNN 和 NNK 的總量≤2 mg/kg（以干質(zhì)量計(jì)）［8］，瑞典火柴（Swedish Match）公司對(duì)口含煙產(chǎn)品的質(zhì)量安全要求是：NNN 和 NNK 的總量≤ 0.95 mg/kg［9］。

目前，國(guó)內(nèi)外常用的控制或降解TSNAs 的方法有3 種：①對(duì)口含煙原料進(jìn)行加熱殺菌或微波處理。此方法可有效減少微生物，防止煙葉原料中硝酸鹽降解為亞硝酸鹽，從而防止TSNAs 含量增加［10-12］，但此方法對(duì)調(diào)制后煙葉原料中TSNAs含量的影響較?。?3］。②在煙葉調(diào)制過(guò)程中添加對(duì)揮發(fā)性亞硝胺及TSNAs 合成有明顯阻斷作用的生物酶制劑［14］。在此方法中，要篩選出耐有機(jī)溶劑和耐酸堿、耐高溫處理的生物酶體系較難，實(shí)驗(yàn)成本較高且反應(yīng)條件苛刻，不利于實(shí)際應(yīng)用。③采用沸石分子篩、活性炭或介孔氧化硅等吸附性材料，通過(guò)液相吸附法降低煙草原料萃取液中亞硝胺等有害成分［15-19］，再將處理后的萃取液用于樣品加工過(guò)程中。此方法也稱離線吸附法，在造紙法再造煙葉的生產(chǎn)過(guò)程中較為常用。目前成熟的口含煙生產(chǎn)工藝主要是先對(duì)煙草粉末進(jìn)行含水率和pH 調(diào)節(jié)，然后在熱處理發(fā)酵后進(jìn)行香味調(diào)節(jié)。在離線吸附法中，煙草粉末需經(jīng)水浸泡萃取，工藝流程較長(zhǎng)，生產(chǎn)成本較高，且產(chǎn)品質(zhì)量波動(dòng)較大。對(duì)于口含煙來(lái)說(shuō)，目前TSNAs 降低技術(shù)存在一定的問(wèn)題，不適合現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝。

在本研究中，采用原位吸附技術(shù)，調(diào)節(jié)煙草粉末的含水率將煙末濕潤(rùn)，使其所含的TSNAs 緩慢釋放，然后加入一定比例的活性炭吸附材料，使吸附材料微粉黏附在煙末表面，通過(guò)考察不同條件下口含煙中TSNAs 含量的降低幅度，并采用現(xiàn)有口含煙生產(chǎn)工藝對(duì)該吸附方法進(jìn)行模擬應(yīng)用驗(yàn)證，旨在為降低口含煙中TSNAs 的含量提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙草粉末：晾曬煙（5 級(jí)）、白肋煙（B3F）；椰殼活性炭（AC，比利時(shí)Chemviron Carbon 公司）；氧化鋅改性椰殼活性炭（5%ZnO-AC，本實(shí)驗(yàn)室自制）。人乳腺癌細(xì)胞MCM-7（細(xì)胞No. 115，德國(guó)DSMZ 公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：N-亞硝基降煙堿（NNN，≥98%）、N-亞硝基新煙草堿（NAT，≥98%）、N-亞硝基假木賊堿（NAB，≥98%）、4-（N-甲基亞硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK，≥98%），氘代-N-亞硝基降煙堿（NNN-d4，≥99%）、氘代-N-亞硝基新煙草堿（NAT-d4，≥99%）、氘代-N-亞硝基假木賊堿（NAB-d4，≥99%）、氘代 -4-（N- 甲 基 亞 硝 胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK-d4，≥99%）（加拿大TRC 公司）。甲醇（色譜純，泰國(guó)RCI Labscan公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia 公司）；乙酸銨（色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；乙酸（質(zhì)譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；二甲亞砜（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸緩沖液（PBS；BR，美國(guó)Corning 公司）；MTT（噻唑藍(lán)；分析純，南京合耀生物科技有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM（美國(guó)Mediatech 公司）。除特別要求外，本研究中使用的其他試劑均為色譜純，水應(yīng)符合GB/T 6682—2008中一級(jí)水的規(guī)定。

Agilent 1290 高效液相色譜儀、PTFE 濾頭（美國(guó)Agilent 公司）；AB5500 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（美國(guó)AB SCIEX 公司）；Milli-Q50 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率1 000 W）；CP2245 電子天平（感量 0.000 1 g，德國(guó) Sartorius 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 5%ZnO-AC 制備

將1.0 g 椰殼活性炭AC 顆粒加入10 mL 蒸餾水中，并加入一定量金屬鹽 Zn（NO3）2，使最終氧化鋅負(fù)載量為5%；將懸浮液在80 ℃時(shí)攪拌2 h 并蒸干，所得樣品于100 ℃烘箱中過(guò)夜干燥；將所得樣品置于臥式管式爐，以5 ℃·min-1速率從室溫升溫至550 ℃，在氮?dú)饬魉?00 mL·min-1條件下焙燒3 h，得到粉末狀5%ZnO-AC 樣品。

1.2.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：以甲醇為溶劑，分別配制NNN、NNK、NAT 和 NAB 的質(zhì)量濃度均為 500 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。內(nèi)標(biāo)溶液：以甲醇為溶劑，分別配制NNN-d4，NNK-d4，NAT-d4和 NAB-d4的質(zhì)量濃度均為4 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液：以甲醇為溶劑，取4 種單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及內(nèi)標(biāo)溶液配制TSNAs 質(zhì)量濃度分別為0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、2.500 和5.000 ng·mL-1的八級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為10 ng·mL-1。

1.2.3 樣品前處理及分析

稱取0.5 g 煙末樣品置于50 mL 樣品瓶中，加入 150 μL 內(nèi)標(biāo)溶液和 30 mL 100 mmol·L-1乙酸銨水溶液，振蕩萃取45 min；取適量萃取液用0.45 μm PTFE 濾頭過(guò)濾；取濾液進(jìn)行LC-MS/MS 分析。液相色譜條件及質(zhì)譜條件如下：

色譜柱：Waters Xterra MS C18（2.1 mm×50 mm，2.5 μm）；流速：0.22 mL·min-1；柱溫：60 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸的甲醇；檢測(cè)時(shí)間：10 min；梯度洗脫條件見表1。質(zhì)譜掃描方式：正離子掃描；離子源：電噴霧電離源（ESI）；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓：3 000 V；離子源溫度：550 ℃；離子對(duì)的駐留監(jiān)測(cè)時(shí)間（dwell time）：100 ms；氣簾氣壓力：241.3 kPa；碰撞氣流強(qiáng)度：Medium；霧化氣壓力：482.6 kPa；輔助氣壓力：448.2 kPa；入口電壓（EP）：10 V；碰撞池出口電壓（CXP）：5 V。分析物及內(nèi)標(biāo)的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)等質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.2.4 生物堿含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.200 g 樣品置于15 mL 試管中，加入100μL 內(nèi)標(biāo)溶液、1.5 mL 10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaOH溶液以及3 mL 甲基叔丁基醚，旋緊旋蓋，充分振蕩5 min；室溫放置（24±2）h，取上清液進(jìn)行GC 分析。GC 分析條件為：

毛細(xì)管柱：DB-5（30 m×0.32 mm，1.0 μm）；進(jìn)樣量：1.0 μL，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：He（99.999%），1.7 mL/min；升溫程序：110 ℃下保持5 min，以10 ℃·min-1的速率升至185 ℃，再以6 ℃·min-1的速率升至 250 ℃，保持 10 min；檢測(cè)器：FID；檢測(cè)器溫度：300 ℃。

1.2.5 活性炭吸附材料細(xì)胞毒性檢測(cè)

向 96 孔板加入 20 μL 含有 5.0×103個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。向 96 孔板加入 20 μL 5 mg·mL-1吸附材料的磷酸緩沖液（PBS）分散液，避光孵育 3 h；以100 μL 未加吸附材料溶液的培養(yǎng)基作為對(duì)照組。隨后，加入 20 μL 質(zhì)量濃度為 5 mg·mL-1的 MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h。每孔加入50 μL 二甲基亞砜（DMSO）溶解細(xì)胞代謝產(chǎn)生的結(jié)晶紫，5 min 后用分光光度法檢測(cè)570 nm 處的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞活性（以試驗(yàn)組與對(duì)照組在570 nm 處吸光度的比值表示細(xì)胞活性，其中對(duì)照組細(xì)胞活性記為100%）。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions

表2 各目標(biāo)化合物的定量離子、定性離子和碰撞能Tab.2 Quantitative ion，qualitative ion and collision energy of each target analyte

1.2.6 活性炭吸附材料原位吸附試驗(yàn)

（1）原位吸附預(yù)實(shí)驗(yàn)。取100 g 煙末原料，加入蒸餾水調(diào)節(jié)煙末含水率，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入一定量的吸附材料并混合均勻，靜置一段時(shí)間后取樣進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組未添加吸附材料。

（2）口含煙生產(chǎn)模擬應(yīng)用中吸附材料的原位吸附試驗(yàn)。取5 kg 口含煙原料，加入一定比例的鹽水和緩沖溶液，調(diào)節(jié)含水率為35%～45%和pH為7.5 ～8.5；加入4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）活性炭微粒，其粒徑為400 目（0.037 mm），對(duì)照組未添加活性炭微粒，充分?jǐn)嚢杌靹颍湃牒嫦湟?2 ℃加熱24 h；取出冷卻，放入小試生產(chǎn)線包裝。取口含煙小包樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法同1.2.3 節(jié)。

2 結(jié)果與討論

2.1 活性炭添加量對(duì)TSNAs 吸附的影響

取3 份煙末各100 mg，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、5%、10%的AC 并混合均勻，然后將混合物置于小砂芯漏斗中，在避光條件下緩慢加入10 mL蒸餾水，收集濾出液并檢測(cè)其中TSNAs 含量；對(duì)照組未添加吸附材料，其他操作同試驗(yàn)組。由表3可以看出，隨著AC 添加量的增加，其對(duì)TSNAs 的吸附量明顯增加。

表3 不同AC 添加量下煙末沖洗液中TSNAs 的吸附情況Tab.3 Adsorption of TSNAs in tobacco powder washing solutions at different AC addition rates

2.2 活性炭粒徑對(duì)TSNAs 吸附的影響

本研究中所用椰殼活性炭AC 原始粒徑在30目（0.613 mm）左右，為考察AC 粒徑對(duì)TSNAs 吸附率的影響，將椰殼活性炭研磨，然后選取30 目、60目（0.420 mm）、400 目（0.037 mm）左右的活性炭進(jìn)行對(duì)比。在活性炭添加量為5%、不調(diào)節(jié)煙末含水率的情況下進(jìn)行原位吸附試驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4 可知：隨著 AC 粒徑的降低，AC 對(duì) TSNAs 的吸附率從4.8%升至19.1%；活性炭對(duì)NNK 有較好的吸附選擇性，NNK 吸附率從17.5%升至36.7%。可見，降低活性炭材料的粒徑后，其吸附能力增加。

表4 不同粒徑AC 材料對(duì)TSNAs 的吸附率Tab.4 Adsorption rates of AC materials of different particle sizes to TSNAs

2.3 改性活性炭對(duì)TSNAs 吸附的影響

在不調(diào)節(jié)煙末含水率情況下，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的氧化鋅改性前后的椰殼活性炭，充分混勻并取樣檢測(cè)，結(jié)果見圖1?？梢钥闯?，氧化鋅改性前后活性炭的吸附性能存在明顯差異。5%ZnO-AC 對(duì) TSNAs 的吸附率約為 AC 的 3 倍，并且其對(duì)不同組分的吸附選擇性也高于AC?？赡茉蚴茄趸\陽(yáng)離子對(duì)N—NO 基團(tuán)的靜電吸引力可提高 5%ZnO-AC 對(duì) TSNAs 的吸附性［20］。

2.4 煙末含水率對(duì)TSNAs 吸附的影響

圖1 氧化鋅改性前后椰殼活性炭對(duì)TSNAs 吸附率Fig.1 Adsorption rates of coconut shell AC to TSNAs before and after zinc oxide modification

選取氧化鋅改性前后的活性炭吸附材料，在吸附材料添加量為4%、粒徑為400 目左右時(shí)，考察吸附材料對(duì)含水率分別為12%和40%的煙末中TSNAs 的吸附率，結(jié)果見圖2。可以看出，隨著煙末含水率的增大，活性炭材料對(duì)TSNAs 的吸附率升高?？赡茉蚴呛试龃笥欣赥SNAs 的溶出和擴(kuò)散，進(jìn)而促進(jìn)活性炭材料對(duì)TSNAs 的更有效吸附。

圖2 活性炭材料對(duì)不同含水率煙末中TSNAs 的吸附情況Fig.2 Adsorption of AC materials to TSNAs in tobacco powder with different moisture contents

2.5 吸附時(shí)間對(duì)TSNAs 吸附的影響

為考察吸附時(shí)間對(duì)煙末中TSNAs 吸附率的影響，向含水率40%煙末中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、粒徑400 目左右的 AC，混合均勻后分別放置 0、3、6、12、24、48 h，然后取樣檢測(cè)，并與未添加活性炭吸附材料的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果（圖3）表明：隨著靜置時(shí)間的增加，AC 對(duì)煙末中TSNAs 的吸附率呈上升趨勢(shì)，靜置6 h 后吸附率為32.7%，48 h 時(shí)達(dá)到了46.6%。可見，煙末中TSNAs 的溶出需要一定的時(shí)間，靜置過(guò)程中活性炭會(huì)不斷吸附潮濕煙末中溶出的TSNAs。

對(duì) NNN 和 NNK 的分析結(jié)果表明，AC 對(duì) NNK有較高的吸附選擇性，如圖4 所示。結(jié)合圖3 和圖4 可知：靜置 6 h 后，TSNAs 減少 32.7%，而 NNK 和NNN 分別減少58.8%和23.5%；靜置48 h 后，TSNAs 減 少 39.5% ，而 NNK 和 NNN 分 別 減 少67.7%和27.5%。

圖3 吸附時(shí)間對(duì)活性炭（AC）TSNAs 吸附率的影響Fig.3 Effect of adsorption time on adsorption rate of activated carbon（AC）to TSNAs

圖4 吸附時(shí)間對(duì)活性炭（AC）的NNN 和NNK吸附率的影響Fig.4 Effect of adsorption time on adsorption rates of activated carbon（AC）to NNN and NNK

2.6 活性炭吸附材料在口含煙生產(chǎn)工藝中的模擬應(yīng)用

2.6.1 活性炭吸附材料對(duì)TSNAs 的吸附率

考慮到活性炭吸附材料的成本和易獲得性，在前期條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選取未改性的AC，在AC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、粒徑400 目左右的條件下，進(jìn)行口含煙生產(chǎn)工藝驗(yàn)證，并將最后的產(chǎn)品與對(duì)照組對(duì)比，結(jié)果如圖5 所示?？梢钥闯觯c對(duì)照組相比，在扣除含水率的影響后，AC 對(duì)口含煙中TSNAs 的吸附率達(dá)到26.9%，且對(duì)NNK 有更好的吸附選擇性，吸附率為50.2%。

圖5 口含煙生產(chǎn)工藝模擬應(yīng)用中活性炭（AC）對(duì)TSNAs的吸附情況Fig.5 Adsorption of activated carbon（AC）to TSNAs in oral tobacco products in simulation production process

2.6.2 活性炭吸附材料對(duì)總生物堿的影響

為考察采用活性炭吸附材料時(shí)口含煙中煙堿及次級(jí)生物堿含量的降低情況，分析了AC 對(duì)生物堿的吸附情況。從表5 可以看出，AC 對(duì)總生物堿的吸附率為8.9%。

表5 AC 對(duì)生物堿的吸附率Tab.5 Adsorption rates of AC to alkaloids

2.7 活性炭吸附TSNAs 的穩(wěn)定性

在本研究中，活性炭與煙粉混合后不易分離，為考察TSNAs 被活性炭材料吸附后是否穩(wěn)定，采用活性炭與TSNAs 標(biāo)樣溶液及純水體系相互作用進(jìn)行研究。取1 mL 質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL 的TSNAs 溶液，加水稀釋到10 mL（樣品1）；加入0.160 g 椰殼活性炭，振蕩 30 min，10 000 r/min 離心1 min 取上清液（樣品2）；離心后的活性炭用10 mL 去離子水洗 1 遍，10 000 r/min 離心 1 min 取上清液（樣品3）；離心后的活性炭用10 mL 去離子水浸泡30 min，10 000 r/min 離心 1 min 取上清液（樣品4）。值得注意的是，在進(jìn)行離心分離時(shí)，顆粒較小的活性炭易黏附在管壁上，而顆粒較大的活性炭易分離。檢測(cè)時(shí)，取4 個(gè)樣品各1 mL，分別加入29 mL 100 mmol·L-1的乙酸銨萃取溶液，并在加入內(nèi)標(biāo)后進(jìn)行分析，結(jié)果見表6。由表6 可知：加入活性炭后可吸附溶液90%以上的TSNAs；樣品2 中僅含有少量TSNAs 未被活性炭吸附；樣品3 中僅有痕量NAT 測(cè)出；樣品4 中TSNAs 未檢出。關(guān)于活性炭吸附TSNAs 的時(shí)間、溫度等條件下的穩(wěn)定性，還有待進(jìn)一步深化研究驗(yàn)證。

2.8 活性炭吸附材料的細(xì)胞毒性

鑒于口含煙的吸食方式，添加活性炭吸附材料需要考察其安全性，為了檢測(cè)AC 吸附材料的細(xì)胞毒性，本研究中進(jìn)行了MTT 比色法［21-23］檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞MCM-7 細(xì)胞活力的測(cè)定。結(jié)果顯示，添加5 mg·mL-1AC 的PBS 分散液時(shí)，試驗(yàn)組細(xì)胞活性和對(duì)照組相比為117.7%，細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有受到影響，說(shuō)明這種活性炭吸附材料無(wú)細(xì)胞毒性。

表6 活性炭洗脫液中TSNAs 的含量Tab.6 Contents of TSNAs in activated carbon eluent（ng）

3 結(jié)論

在實(shí)驗(yàn)室條件下，建立了椰殼活性炭原位吸附法降低口含煙中TSNAs 的方法，對(duì)椰殼活性炭原位吸附煙草中TSNAs 的條件進(jìn)行了考察。增加活性炭材料的添加量、降低活性炭材料的粒徑、提高煙草粉末的含水率和延長(zhǎng)煙草粉末與活性炭吸附材料的接觸時(shí)間均可提高活性炭對(duì)TSNAs 的吸附率。經(jīng)氧化鋅改性后可進(jìn)一步提高材料對(duì)煙末中TSNAs 的吸附率。

在考慮活性炭吸附材料使用的可行性上，結(jié)合口含煙生產(chǎn)工藝，初步探索了椰殼活性炭材料在口含煙工藝中的應(yīng)用。煙草粉末含水率為40%時(shí)，加入占煙草原料質(zhì)量4%、粒徑400 目左右的椰殼活性炭，可有效吸附口含煙中25%以上的TSNAs，且吸附材料對(duì)口含煙中生物堿的吸附量較小。加入活性炭吸附材料后，不會(huì)明顯降低口含煙產(chǎn)品的煙堿滿足感。

盡管本研究中對(duì)所添加的活性炭材料進(jìn)行了細(xì)胞毒性驗(yàn)證，但本研究?jī)H為試驗(yàn)階段的初步探索，產(chǎn)品的長(zhǎng)期使用安全性和消費(fèi)者接受程度等方面還有待進(jìn)一步深入研究。