權(quán)聯(lián)姣 秦婧婧 權(quán)元鼎

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，炎癥反應(yīng)、凋亡、氧化應(yīng)激等與其密切相關(guān)[1-2]。丹參是一種傳統(tǒng)的中藥，具有抗炎、抗氧化、抗血栓、免疫調(diào)節(jié)等作用[3]。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)丹參及其制劑在DR的治療過程中發(fā)揮重要作用[4-5]，但其機(jī)制目前尚不清楚。本研究采用高糖處理人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRECs)構(gòu)建DR體外的細(xì)胞模型，探討丹參提取物對(duì)HRECs凋亡的影響及其作用機(jī)制。

材料與方法

1.材料：HRECs購自美國菌種保藏中心(ATCC)細(xì)胞庫；丹參購自哈爾濱市同仁堂大藥房；杜氏貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)購自美國HyClone公司；胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)、二辛可寧酸(BCA)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-FITC/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-8酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3兔單克隆抗體、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相關(guān)X蛋白(Bax)兔單克隆抗體、Bcl-2兔單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；核因子(NF)-κB兔單克隆抗體、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)兔單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購自美國Abcam公司。

2.方法

(1)丹參提取物的制備：參照文獻(xiàn)[6]中制備丹參提取物的方法，將丹參40 ℃烘干，粉碎成干粉，然后加入10倍水于80 ℃提取2次，每次提取30 min。過濾，棄去濾渣，合并濾液，過濾，將溶液定容至100 mL，以2 000 r/min離心10 min，上清即為丹參提取物。

(2)細(xì)胞培養(yǎng)方法和分組情況：將凍存的HRECs常規(guī)復(fù)蘇，接種到含10%胎牛血清、5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長匯合率達(dá)80%以上時(shí)以胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞分為5組，5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組，30.0 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)的細(xì)胞作為高糖組[7]，30.0 mmol/L葡萄糖和5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml丹參提取物培養(yǎng)的細(xì)胞作為丹參提取物低、中、高濃度組。

(3)CCK-8法檢測HRECs活性：5組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后向每孔細(xì)胞中加入10 μl CCK-8溶液，在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測波長570 nm處細(xì)胞光密度值(OD值)，以O(shè)D值反映細(xì)胞活性。重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值。

(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測HRECs凋亡率：各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞，取100 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin Ⅴ-FITC溶液5 μl，混勻后避光反應(yīng)10 min，再加入PI染液5 μl，混勻后避光孵育20 min，最后加入400 μl 1×Binding Buffer結(jié)合緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀測定，分析細(xì)胞凋亡率。重復(fù)試驗(yàn)3次，取其平均值。

(5)ELISA檢測炎癥因子含量：分別收集處理48 h的HRECs上清液，分別參照TNF-α、IL-1β和IL-8 ELISA檢測試劑盒說明書測定TNF-α、IL-1β和IL-8的含量。重復(fù)試驗(yàn)3次，取其平均值。

(6)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測HRECs中蛋白表達(dá)水平：5組HRECs處理48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA試劑盒進(jìn)行定量分析。將蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，在5%脫脂奶粉中封阻2 h，TBS緩沖液加吐溫(TBST)洗膜后加入一抗(Caspase-3一抗1∶500稀釋，Bax一抗1∶500稀釋，Bcl-2一抗1∶500稀釋，NF-κB一抗1∶800稀釋，p-NF-κB一抗1∶800稀釋)，在4 ℃下過夜雜交。TBST洗膜后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000稀釋)，于室溫下雜交2 h，TBST洗膜后，采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液顯影，轉(zhuǎn)移至暗室采集圖像，使用Image J軟件分析條帶灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算各組HRECs中目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.5組HRECs活性比較：CCK-8檢測結(jié)果顯示，高糖組HRECs的OD值較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)；與高糖組比較，丹參提取物低、中、高濃度組HRECs的OD值均依次升高(P<0.05)。見圖1。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP<0.05；與低濃度組比較，cP<0.05圖1 5組HRECs的活性比較結(jié)果

2.5組HRECs凋亡率比較：流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高糖組HRECs凋亡率明顯升高(P<0.05)；與高糖組比較，丹參提取物低、中、高濃度組HRECs凋亡率均明顯依次降低，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP<0.05；與低濃度組比較，cP<0.05；與中濃度組比較，dP<0.05圖2 5組HRECs凋亡率比較

3.5組HRECs中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較：Western blot檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高糖組HRECs中Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖組比較，丹參提取物低、中、高濃度組HRECs中Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)明顯依次下降，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯依次升高，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP<0.05；與低濃度組比較，cP<0.05；與中濃度組比較，dP<0.05圖3 5組HRECs中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 A：Caspase-3蛋白；B：Bax蛋白；C：Bcl-2蛋白；D：Western blot檢測結(jié)果

4.5組HRECs炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8含量比較：ELISA檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高糖組HRECs上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8含量明顯升高(P<0.05)；與高糖組比較，丹參提取物低、中、高濃度組HRECs上清液中TNF-α、IL-1β和IL-8含量明顯依次降低，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP<0.05；與低濃度組比較，cP<0.05；與中濃度組比較，dP<0.05圖4 5組HRECs中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8含量比較 A：TNF-α；B：IL-1β；C：IL-8

5.5組HRECs p-NF-κB蛋白表達(dá)比較：Western blot檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高糖組HRECs中p-NF-κB蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與高糖組比較，丹參提取物低、中、高濃度組HRECs中p-NF-κB蛋白表達(dá)依次下降，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP<0.05；與低濃度組比較，cP<0.05；與中濃度組比較，dP<0.05圖5 5組HRECs p-NF-κB蛋白表達(dá)比較A：5組HRECs NF-κB和p-NF-κB蛋白表達(dá)水平比較；B：5組HRECs NF-κB和p-NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，丹參提取物具有抗炎、抗氧化等作用，在治療DR中取得了較好的療效[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的HRECs活力明顯降低，且凋亡率明顯升高，提示高糖能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與DR過程。這與近期關(guān)于DR患者存在微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果相符[9-11]。不同濃度的丹參提取物均可提高高糖誘導(dǎo)的HRECs活性，抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且具有濃度依賴的關(guān)系，提示丹參提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRECs具有保護(hù)作用。Bax和Bcl-2均屬于Bcl-2基因家族成員，Bax是促凋亡基因之一，其過度表達(dá)可引起B(yǎng)cl-2對(duì)細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)的失衡。當(dāng)細(xì)胞受到損傷后，Bcl-2構(gòu)象發(fā)生改變，引起線粒體釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)而激活下游的Caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[12-13]。本研究結(jié)果顯示，高糖能夠誘導(dǎo)Caspase-3和Bax蛋白高度表達(dá)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，而丹參提取物能夠降低Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平，提高Bcl-2蛋白表達(dá)水平，提示丹參提取物可通過阻礙Bcl-2構(gòu)象改變，抑制Caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制細(xì)胞凋亡。

NF-κB是轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族成員之一，在免疫、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞生長發(fā)育過程中起重要作用[14]。有關(guān)研究結(jié)果顯示，NF-κB信號(hào)通路能夠調(diào)控下游基因Bax和Bcl-2的表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡過程[15]。丹參可通過抑制NF-κB信號(hào)通路參與肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的過程[16]。本研究結(jié)果顯示，高糖能夠促進(jìn)Bax蛋白的表達(dá)，而丹參提取物能夠抑制高糖誘導(dǎo)的Bax蛋白的表達(dá)，提示丹參提取物可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活抑制高糖誘導(dǎo)的HRECs凋亡。有研究結(jié)果表明，NF-κB通過調(diào)控細(xì)胞因子、趨化因子等參與調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)，NF-κB的過度激活是炎癥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[17-18]。丹參可通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控炎癥因子和黏附因子等的表達(dá)，影響細(xì)胞功能[19-20]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-8的含量明顯增多，丹參提取物處理后TNF-α、IL-1β和IL-8的含量明顯減少，提示丹參提取物可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活降低炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8分泌，從而抑制細(xì)胞凋亡。本研究僅對(duì)丹參提取物影響NF-κB信號(hào)通路的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探究，涉及該通路上游或下游基因表達(dá)情況的檢測尚顯不足，后續(xù)研究將對(duì)此進(jìn)行補(bǔ)充。

綜上所述，丹參提取物可抑制高糖誘導(dǎo)的HREOS凋亡，其作用機(jī)制可能是抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)，降低炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-8分泌來實(shí)現(xiàn)的。提示丹參提取物可通過抑制NF-κB信號(hào)通路，對(duì)抗炎癥反應(yīng)，降低細(xì)胞凋亡從而起保護(hù)HREOS的作用。