喬改霞，王榮，劉玉娟，曾繼娟，徐美隆1,，謝軍1,，范培格*

（1. 中國科學院植物研究所，北京 100093；2. 寧夏林業(yè)研究院/種苗生物工程國家重點實驗室，寧夏銀川 750004；3. 寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021；4. 中國葡萄酒產業(yè)技術研究院，寧夏銀川 750021）

抗性育種中抗病育種是人們一直追求的育種目標，尤其是在歐洲和美洲國家。霜霉病是世界上最嚴重的真菌病害之一，而白粉病幾乎存在于所有的釀酒葡萄產區(qū)[1]。黃宏娟[2]研究表明，感染白粉病的葡萄釀制的酒具有苦味和其他不良風味；而霜霉病會導致葉片光合性能下降，嚴重的會造成早期落葉，從而使葡萄營養(yǎng)不足，降低葡萄果實的成熟度[3-4]。美洲種葡萄是抗病性較強的種質資源，能抗多種真菌病，同時也具有較強的抗寒性能，但其具有的濃烈狐香味，以及青草味等，釀出的酒不易被接受[5-6]。山葡萄能耐-40 ℃低溫，是葡萄屬中最抗寒的種，對白粉病、白腐病等真菌病害抗性強，但不抗霜霉病[7]。歐亞種葡萄雖然具有較好的果實品質特性，但抗寒性及抗病性較差[8-9]。

寧夏賀蘭山東麓產區(qū)是我國集中連片面積最大的葡萄酒產區(qū)，但當?shù)貥O端的大陸性季風氣候條件下，休眠季干旱寒冷，生長季雨熱同季，導致歐亞種釀造品種冬季需要埋土防寒，夏季需要噴施大量化學農藥，已成為阻礙葡萄與葡萄酒產業(yè)健康發(fā)展的重要瓶頸。因此，選育、種植抗逆的適宜品種是解決這一瓶頸問題的最有效途徑?？购灯贩N選育一直是我國釀酒葡萄選育的重要方向，利用抗寒性極強的山葡萄為親本已選育出了一些優(yōu)良品種，如‘北紅’‘北玫’等歐山雜種。但這些品種在雨熱同季的氣候條件下也會感染霜霉病等病害。如何在選育抗寒旱新品種的同時，引入抗病基因是當前我國抗逆育種需要解決的問題。

本研究以含山葡萄血統(tǒng)的歐山雜種與含有河岸葡萄（V. riparia）、美洲葡萄（V. labrusca）、歐亞種葡萄（V. vinifera）血統(tǒng)的雜種后代進行雜交獲得的多種群雜交群體后代典型株系為材料，分別以歐山雜種‘北玫’（V. vinifera×V. amurensis）、‘北紅’（V. vinifera×V.amurensis），歐美雜種‘威代爾’（V. vinifera×V.labrusca），歐亞種‘貴人香’（V. vinifera）為對照，進行抗病性研究，旨在根據(jù)其抗病特點，提出育種方向及親本選擇的可行性，為抗病育種提供科學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料：中科院西北生物中心平吉堡基地露地越冬的4年生含山葡萄、河岸葡萄、美洲葡萄、歐亞種葡萄血統(tǒng)的多種群雜交后代05-1群體，它們是以‘北紅’為母本，‘7-11-49’[（Minnesota 78（Beta×Witt）×V.riparia）×V. vinifera]為父本雜交而來。同地塊的2個歐山雜種‘北玫’‘北紅’以及1個歐美雜種‘威代爾’和1個歐亞品種‘貴人香’為對照，共計20個種質。

1.2 種植情況

試材采用‘廠’字形樹形，行距3.0 m，株距1.0 m。栽培管理一致。冬季不埋土。

1.3 試驗方法

1.3.1 霜霉病鑒定

（1）田間自然鑒定。于2019年8月在葡萄霜霉病發(fā)生穩(wěn)定期對各種質葡萄霜霉病發(fā)生情況進行調查，選取枝條頂端第5～14片共10片葉進行觀測。每個種質調查10個枝條，共100片葉。

霜霉病病情調查采用Desaymard分級法[10]：

根據(jù)葉片病斑面積占全葉面積百分率（R）劃分病級：0級：全葉無病斑R＝0；1級：0＜R≤5%；2級：5%＜R≤25%；3級：25%＜R≤50%；4級：50%＜R≤75%；5級：R＞75%或葉片枯死。

（2）室內接種鑒定。采集新鮮葡萄葉片，用無菌水沖洗掉表面的灰塵，將病菌配成濃度為1×105個/毫升的孢子囊懸浮液，噴霧接種到感病葡萄離體葉片背面進行繁殖，葉柄用潤濕脫脂棉包裹保濕，置于底部墊有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，封口保濕。22～28 ℃培養(yǎng)4～7 d，收集新鮮病原菌用于抗病性評價。

采集每個葡萄種質枝條頂端第4～6節(jié)位的健康新鮮葉片，用自來水沖洗干凈，并吸干水分，再用75%的酒精滅菌20 s，1%的次氯酸鈉溶液滅菌5～7 min，無菌水沖洗3次后，用直徑為1 cm的打孔器在葉片背面畫圈，每個重復5片葉，葉背朝上放入有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，噴霧接種濃度為1×105個/毫升的孢子囊懸浮液，在密封保濕、25～28 ℃、每天光照12 h條件下培養(yǎng)。接種7 d后調查發(fā)病情況。每個處理采樣15片葉。

1.3.2 白粉病鑒定

于2019年9月在葡萄白粉病發(fā)生穩(wěn)定期對各種質葡萄白粉病發(fā)生情況進行調查，葉片選樣、分級及計算方法與霜霉病田間調查方法相同。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2017軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析；SPSS 21.0軟件進行方差分析和聚類分析，Origin輔助作圖。

根據(jù)以下公式計算病情指數(shù)，通過病情指數(shù)分析不同葡萄品種對霜霉病及白粉的抗感病情況。

病情指數(shù)＝∑（感病極值×該級發(fā)病葉數(shù)）/（調查總葉片數(shù)×最高感病級別）×100

品種反應型按照國際植物種質委員會（IBPGR）的標準將其分為5級[11]：免疫（I）：病情指數(shù)：0；高抗（HR）：病情指數(shù)≤5；抗?。≧）：5＜病情指數(shù)≤25；感?。⊿）：25＜病情指數(shù)≤50；高感（HS）：50＜病情指數(shù)≤100。

2 結果與分析

2.1 不同葡萄種質田間霜霉病鑒定

田間調查結果表明（表1），供試的20個葡萄種質的葉片發(fā)病率差異較大，‘貴人香’葉片發(fā)病率最高，95%的葉片感染霜霉病，其次是‘05-2-12’，有89%的葉片感染霜霉病，‘05-1-144’發(fā)病率最低，僅有2%的葉片感染。病情指數(shù)反映種質間感病性的差異，根據(jù)霜霉病病情指數(shù)將供試種質大致分為4類：‘貴人香’的病情指數(shù)為66.03，屬于高感品種；‘05-2-12’病情指數(shù)為45.53，屬于感病類；‘05-1-17’‘05-1-133’‘北紅’‘北玫’‘威代爾’等10個種質病情指數(shù)在5～25，屬于抗病類；‘05-1-444’‘05-1-247’‘05-1-220’等8個優(yōu)系病情指數(shù)小于5，屬于高抗類。

2.2 不同葡萄種質室內接種霜霉病鑒定結果

通過20個葡萄種質的室內霜霉病抗性鑒定（表2）結果表明，各種質接種后對霜霉病的抗逆性存在明顯差異?！?5-1-247’抗性最強，‘05-1-444’次之，屬于高抗品系?！?5-1-323’‘05-1-133’等9個優(yōu)系病情指數(shù)在5～25，屬于抗性類別；‘05-1-76’‘北紅’‘北玫’‘威代爾’‘貴人香’等9個種質，病情指數(shù)在25～50，屬于感病類別。方差分析結果表明：‘05-1-247’與‘05-1-444’2個優(yōu)系之間無顯著差異，抗性較強；‘貴人香’‘北紅’‘北玫’‘威代爾’等8個種質之間存在顯著差異，且‘05-1-586’‘貴人香’與其它18個種質之間也存在顯著差異，抗性最弱。

2.3 不同葡萄種質田間白粉病鑒定

田間白粉病鑒定結果（表3）表明，供試的20個葡萄種質田間白粉病的發(fā)病率和病情指數(shù)差異顯著，尤其是群體優(yōu)系的抗性表現(xiàn)從免疫到感病出現(xiàn)了極大的分離?！?5-1-76’‘北玫’‘威代爾’等7個種質田間無白粉病發(fā)病，對白粉病為免疫級別；‘貴人香’‘北紅’‘05-1-155’等9個種質，病情指數(shù)小于5，屬于高抗品種；‘05-1-12’病情指數(shù)為11.37，屬于抗性類別；而‘05-1-87’‘05-1-220’‘05-1-323’3個優(yōu)系，病情指數(shù)在25～50，屬于感病類別。免疫優(yōu)系‘05-1-76’發(fā)病率為0，而感病優(yōu)系‘05-1-323’發(fā)病率高達74%，優(yōu)系間對白粉病的抗性差異較大。

2.4 不同葡萄種質對霜霉病田間和室內接種抗性反應的聚類分析

根據(jù)20個葡萄種質對田間霜霉病的抗性反應進行了聚類分析。結果如圖1所示，當歐式距離系數(shù)為15時，不同葡萄種質對霜霉病田間抗病性可劃分為4類。第一類：抗性較強，包括‘05-1-444’‘05-1-247’等13個種質，病情指數(shù)為0.40～10.04；第二類：抗性中等，包括‘威代爾’‘05-1-323’‘05-1-62’‘北紅’‘05-1-87’共5個種質，病情指數(shù)為12.43～24.60；第三類：感病類別，只有‘05-2-12’，病情指數(shù)達45.53；第四類：高感病類別，‘貴人香’病情指數(shù)高達66.03。

同時，對霜霉病室內的抗性結果進行了聚類分析。結果表明，當歐式距離系數(shù)為12時，可以將20個種質劃分為4類（圖2）。第一類抗性較強，病情指數(shù)在1.33～12.88，如‘05-1-247’‘05-1-17’等9個種質；第二類抗性中等，病情指數(shù)為19.6～21，如‘05-1-155’‘05-1-133’；第三類表現(xiàn)感病，病情指數(shù)為28.12～34.98，包括‘05-1-87’‘05-1-62’等7個種質；第四類為感病較強，病情指為42，如‘05-1-586’和‘貴人香’2個種質。

表2 不同葡萄種質室內接種霜霉病調查情況Table 2 Investigation of downy mildew in different grape germplasms

2.5 不同種質對白粉病田間抗性反應的聚類分析

根據(jù)20個葡萄種質對田間白粉病的抗性反應進行了聚類分析（圖3）。當歐式距離系數(shù)為10時，可將20個種質分為4類。第一類抗性較強，包含‘05-1-76’‘北玫’‘威代爾’等7個免疫種質，病情指數(shù)為0，也包含‘貴人香’‘北紅’‘05-1-155’等9個種質，病情指數(shù)均小于3.57，均為抗性較強種質。第二類抗病中等，只有‘05-1-12’，病情指數(shù)為11.37；第三類為感病種質，有‘05-1-87’‘05-1-220’，病情指數(shù)為25～30；第四類為高感病種質，只有‘05-1-323’，病情指數(shù)為48.8。

3 討論與結論

寧夏賀蘭山東麓產區(qū)是我國集中連片面積最大的葡萄酒產區(qū)，截止到2017年底，葡萄總面積達4.3萬 hm2，其中釀酒葡萄3.8萬 hm2[11]。由于賀蘭山東麓主要為大陸季風性氣候，生長季與雨季同季[12]，且主栽品種是‘赤霞珠’‘美樂’等歐亞種[8]，它們一般不抗霜霉病[13]，在大面積單一種植的同時，加劇了病蟲害的發(fā)生。目前，葡萄霜霉病和白粉病是賀蘭山東麓產區(qū)的主要病害，每年夏季的大面積爆發(fā)嚴重降低了葡萄的產量和品質，使種植效益受到極大損失[14]。雖然利用更新栽培技術、生物防治等方法來預防葡萄病害，也取得了不錯的效果，但是選擇和推廣抗病性強的品種才是保證產業(yè)得到可持續(xù)發(fā)展的有效手段[15]。

葡萄雜交育種是綜合利用親本的優(yōu)良基因培育新品種的基本方式。為了選育優(yōu)質、抗旱寒或者抗病的新品種，雙親必須具有優(yōu)質、抗旱寒或抗病的特性[16]。

表3 不同葡萄種質田間白粉病調查Table 3 Investigation of powdery mildew of different grape germplasms in field

Boubals[17]系統(tǒng)地研究葡萄屬植物對白粉病的抗性，認為北美種群中的美洲葡萄、河岸葡萄抗性最強；在17世紀時，美國育種專家利用抗寒抗病的美洲葡萄與歐洲品種雜交，先后獲得了抗逆性強的‘康克’‘卡托巴’等品種[18]；在19世紀時，法國育種家就利用抗病性較強的美洲種或美洲種與歐亞種葡萄雜交，育成了一批抗霜霉病和白粉病能力強，釀酒品質與歐洲品種相當?shù)男缕贩N，如‘Bronx’‘Castets’等[18]。通常，抗病的歐美第一、二代雜種具有強烈的狐臭味，所釀的葡萄酒不易被接受，現(xiàn)代育種家通過與歐洲種回交的方法，來提高其釀酒品質。如美國紐約州農業(yè)試驗站培育成的新品種‘Cayuga White’‘Lakemont’等就具有較好的抗寒、抗病性能，且具有優(yōu)良的釀酒品質[19]。山葡萄是葡萄屬抗寒性最強的種，20世紀初，中國育種家開始利用山葡萄作為抗寒育種的親本，選育出了多個抗逆性和品質較好的品種，如‘北醇’‘北紅’‘北玫’等[16]。山葡萄沒有強烈的不良味道，有很好的釀酒特性，但山葡萄及其雜種抗病性，尤其是抗霜霉病的特性遠不如美洲血統(tǒng)葡萄品種[7]。因此，引入抗病性較強的美洲血統(tǒng)葡萄雜種后代可豐富抗病基因，選育出既抗寒旱又抗病的新品種。

本研究結果也證明了這一點，16個多種群雜交后代優(yōu)系在田間自然條件下有15個優(yōu)系表現(xiàn)為抗霜霉病，室內接種條件下有11個優(yōu)系屬于抗性類型，‘北紅’‘北玫’‘威代爾’田間表現(xiàn)抗病，但室內接種表現(xiàn)感病，歐亞種‘貴人香’無論是田間自然條件還是室內接種條件均表現(xiàn)不抗，而雜種優(yōu)系表現(xiàn)出較強的抗霜霉病性能。對白粉病抗性方面，有5個優(yōu)系表現(xiàn)為免疫，7個表現(xiàn)為高抗，1個表現(xiàn)為抗?？梢哉f多數(shù)優(yōu)系表現(xiàn)出優(yōu)異的抗病性能。

可見，進行不同抗逆基因多種群的雜交，可提高雜種后代的復合抗逆性，引入含美洲原產野生種高抗病基因，可以在山葡萄雜種后代高抗旱寒的基礎上，增強抗寒性能，提高抗病性。