潘建波

（廣西柳州市動物疫病預(yù)防控制中心 545001）

豬藍(lán)耳病毒可導(dǎo)致妊娠母豬繁殖障礙及呼吸道癥狀，是一種高傳染性、高死亡率的動物疾病。該病最早發(fā)生在美國，荷蘭于1991 年分離出該病毒，1996 年在我國首次報道，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。該病的臨床癥狀一般以食欲下降，耳部、腹部皮膚發(fā)紺、高熱、喘氣為主要癥狀，經(jīng)常會伴有其他疾病混合感染。本研究從臨床送檢的病料中分離鑒定了一株豬藍(lán)耳病毒，旨在為后續(xù)豬藍(lán)耳病毒病的流行病學(xué)調(diào)查及新型防控技術(shù)的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

Vero 細(xì)胞購于上海蓋寧生物科技有限公司；源于參考文獻(xiàn)[2]的豬藍(lán)耳病毒經(jīng)典毒（418bp）、變異病毒（508bp）區(qū)分?jǐn)U增引物PRRSV-F：5’ -TGGGCGACAATGTCCC-3’，PRRSVR：5’ -GCTGAGTATTTTGGGCG-3’ 合成于上海生物工程有限公司；一步法RT-PCR 試劑盒（R055A)、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 購于大連寶生物工程有限公司；RNA/DNA 核酸共提取試劑盒購于杭州博日工程有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM、小牛血清、核酸燃料、細(xì)胞培養(yǎng)瓶等均為本單位保存。

1.2 病料樣品的處理

取廣西柳州市某發(fā)病豬場送檢的組織病料加入3～5 倍體積的滅菌生理磷酸鹽緩沖溶液（PBS）充分研磨，凍融2 次，10000rpm 離心5min，取上清液經(jīng)0.45μm 濾膜過濾，加入青霉素（工作濃度100IU/ml）、鏈霉素（工作終濃度100ug/ml) 于4℃作用6h 后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒的分離

將1.2 處理的樣品接種于已長成單層的Vero 細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，0.5ml/瓶，搖勻后置于37℃吸附1h，然后加入含3%胎牛血清的DMEM 維持液。培養(yǎng)觀察3d，每日觀察，72h 后無病變的進(jìn)行盲傳。

1.4 RT-PCR 檢測

取有細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，凍融一次，10000rpm 離心5min，取上清進(jìn)行總核酸提取。以獲得的總核酸為模板進(jìn)行RT-PCR 擴增。反應(yīng)體系25μl：2×One-Step 反應(yīng)buffer 12.5μl，酶混合液1μl，上、下游引物各1μl（濃度10uM），核酸模板2μl，用無菌水補至25μl。擴增程序：50℃反轉(zhuǎn)錄15min，94℃變性3min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30 個循環(huán)；72℃延伸6min。

2 結(jié)果與分析

（1）將病料接種Vero 細(xì)胞后傳至第2 代時，在48h 后出現(xiàn)細(xì)胞折光率增強，細(xì)胞圓縮，隨后細(xì)胞溶解脫落等細(xì)胞病變（如圖1 所示），毒價測定結(jié)果顯示，該細(xì)胞毒的毒價為104.5TCID50/0.1ml。

（2）RT-PCR 檢測結(jié)果

取8uL RT-PCR 產(chǎn)物，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約508bp 的位置出現(xiàn)目的條帶（見圖2），表明所檢測的樣本中含有豬藍(lán)耳病毒變異株的核酸物質(zhì)。

3 討論

隨著我國養(yǎng)豬模式的不斷改變，規(guī)模化、集約化養(yǎng)殖場不斷增多，呼吸道相關(guān)疾病越來越受到關(guān)注，豬藍(lán)耳病毒可以造成各年齡段豬群感染發(fā)病，導(dǎo)致免疫力降低，從而導(dǎo)致豬瘟、鏈球菌疾病的發(fā)生，同時也影響疫苗免疫效果，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[3]。疫苗免疫是預(yù)防疾病發(fā)生的有效手段之一，為了更好地研制適合于流行毒株的新型疫苗，需要不斷對流行毒株進(jìn)行分離鑒定，本次成功分離鑒定了一株藍(lán)耳病毒，可為后續(xù)新型疫苗研制及流行病學(xué)的調(diào)查提供物質(zhì)基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。