遲向向 劉斯璐

（北京師范大學第二附屬中學未來科技城學校 北京 102209）

《普通高中生物學課程標準（2017 版）》在說明模塊1《分子與細胞》的教學時，提出讓學生了解細胞生命活動中物質(zhì)、能量和信息變化的統(tǒng)一，并且特別提出了“物質(zhì)通過被動運輸、主動運輸?shù)确绞竭M出細胞，以維持細胞的正常代謝活動”的重要概念，在本模塊的教學提示中強調(diào)了“教師要組織好各種觀察、實驗等探究性學習活動，從而幫助學生增加感性認識，克服對微觀結(jié)構(gòu)認識的困難，使學生領(lǐng)悟科學研究的方法并習得相關(guān)的操作技能”。在教學中應讓學生積極參與動手和動腦的活動，通過探究性學習活動或完成工程學任務(wù)，從而加深對生物學概念的理解，提升應用知識的能力，培養(yǎng)創(chuàng)新精神，進而能用科學的觀點、知識、思路和方法，探討或解決現(xiàn)實生活中的某些問題［1］。

人教版高中生物學必修1《分子與細胞》中第4章第3 節(jié)“物質(zhì)跨膜運輸?shù)姆绞健敝兄攸c介紹了2種運輸方式：被動運輸和主動運輸。其中對于被動運輸，教材中以植物細胞的吸水和失水（即質(zhì)壁分離實驗）簡單幫助學生增加直觀認知。而對于主動運輸，作為一種重要的運輸方式，它保證了細胞可按照生命所需主動吸收營養(yǎng)物質(zhì)，排出代謝廢物，充分體現(xiàn)了生命活動的主動性。但教材卻缺乏相關(guān)實例，僅以動畫模型的方式作簡單介紹。教師在教學中常使用動畫模擬的形式，這種方式的教學效果方面遠不及動手實驗。學生在對主動運輸?shù)? 個重要特點（即需要載體和能量）的理解上存在很大障礙。本實驗以此為基礎(chǔ)，選用細胞呼吸抑制劑抑制細胞內(nèi)能量的供應，驗證主動運輸需要能量，同時還對不同的細胞呼吸抑制劑進行了比較和篩選，綜合考慮多種因素，最終確定丙二酸鈉是最適合在高中生物學實驗中推廣的細胞呼吸抑制劑。

1 實驗原理

1.1 實驗試劑選擇

1.1.1 目標離子的選擇 鈉離子是植物所需的礦物質(zhì)元素之一。高等植物在吸收鈉離子時，需要具有以H+為工作離子的質(zhì)膜ATP 酶。它水解ATP 的部分在質(zhì)膜的細胞質(zhì)一側(cè)，ATP 水解產(chǎn)生的能量將細胞質(zhì)中的H+泵至膜外，使膜內(nèi)H+濃度降低而膜外H+濃度升高，同時產(chǎn)生膜電位的過極化。使質(zhì)膜兩側(cè)產(chǎn)生了質(zhì)子濃度梯度和膜電位梯度，這二者之和稱為電化學勢梯度，又稱為質(zhì)子動力，驅(qū)動鈉離子進入到細胞中，這種運輸方式稱為次級主動運輸，此過程需要消耗能量［2］。能量由細胞中的直接能源物質(zhì)ATP 水解提供，而細胞呼吸又是ATP 的重要來源之一，如果抑制細胞呼吸，以主動運輸方式進入細胞的鈉離子的運輸速率就會受到阻礙。而鈉鹽的種類豐富多樣，為了最大程度地保證實驗結(jié)果不受其他因素干擾，實驗選用了植物MS 培養(yǎng)基重要組成成分之一的鉬酸鹽。鉬酸鹽是一種強堿弱酸鹽，而對于溶液pH 值的作用，鈉離子的影響更大，其次鉬酸鈉溶于水無色透明，不影響實驗觀察，并且毒性及環(huán)境污染性極低、易獲取，更適合于中學實驗。

1.1.2 細胞呼吸抑制劑的選擇

1）疊氮鈉。細胞呼吸過程是依靠于分子氧在內(nèi)的電子傳遞系統(tǒng)或電子傳遞鏈完成。電子傳遞鏈位于線粒體內(nèi)膜，是由遞電子體和遞氫體組成的，傳遞體由4 個復合體組成，電子通過這些復合體傳遞到分子氧，此過程可被某些特異性的抑制劑所抑制［3］。疊氮鈉就是一種能抑制電子從復合體Ⅳ轉(zhuǎn)移到氧氣的轉(zhuǎn)移性抑制劑［4］。

2）丙二酸和丙二酸鈉。在呼吸作用的三羧酸循環(huán)中，琥珀酸在琥珀酸脫氫酶的催化下被氧化生成延胡索酸，琥珀酸脫氫酶含有鐵硫中心和共價結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），來自琥珀酸的電子通過FAD 和鐵硫中心，然后進入電子傳遞鏈［5］。丙二酸的結(jié)構(gòu)和琥珀酸類似，可與琥珀酸競爭性地結(jié)合酶的活性中心，是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑，所以可阻斷三羧酸循環(huán)［6］。丙二酸鈉是線粒體呼吸鏈氧化磷酸化酶系復合體Ⅱ中琥珀酸脫氫酶的可逆性抑制劑。

1.2 實驗材料選擇 如何檢測鈉離子的運輸過程？學生在初中階段就已知鈉離子是一種強堿鹽，能改變細胞內(nèi)的pH 值，而在植物細胞內(nèi)恰好存在一種天然的酸堿指示劑——花青素，能隨著細胞內(nèi)pH 值的變化發(fā)生明顯的顏色變化［7］，在堿性環(huán)境中會變成藍色甚至深藍色，而在酸性環(huán)境中則變成紅色。在“植物細胞的質(zhì)壁分離實驗”實驗中，學生恰巧接觸過這樣一種富含花青素的材料——紫色洋蔥，其外表皮細胞有紫色大液泡，操作簡單、效果較好。

2 實驗方法

1）制片：撕取紫色洋蔥外表皮分別置于蒸餾水、0.1 mol／L NaN3、0.1 mol／L 丙二酸、0.1 mol/L丙二酸鈉中浸泡2 min 后制作臨時裝片。

2）觀察：顯微鏡觀察細胞顏色及形態(tài)。

3）實驗：從蓋玻片的一端滴加2 mol／L 鉬酸鈉溶液，另一端用吸水紙吸引，觀察并記錄實驗現(xiàn)象。

3 實驗結(jié)果

3.1 鈉離子的跨膜運輸會使細胞內(nèi)pH 值發(fā)生改變，引起花青素顏色變化 從圖1（本文附圖見封四）可觀察到，隨著鈉離子的跨膜運輸，細胞內(nèi)花青素的顏色由淺紫色逐漸變?yōu)樗{色，最后變?yōu)樯钏{色。此過程顏色變化非常迅速，少數(shù)細胞在2 min后即變?yōu)樯钏{色，其他部分細胞基本在5.5 min左右全部變色。

3.2 呼吸酶抑制劑疊氮鈉能抑制鈉離子的跨膜運輸 通過實驗1 的結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)鈉離子的跨膜運輸?shù)拇_會引起細胞內(nèi)的顏色變化，且此過程的速度較快。鈉離子是以主動運輸?shù)男问娇缒み\輸，此過程最主要的特點是需要ATP 水解提供能量，而細胞內(nèi)ATP 的主要來源之一是細胞呼吸。加入細胞呼吸抑制劑后，鈉離子的轉(zhuǎn)運速度是否會受影響？

圖2 中，與對照組相比，經(jīng)疊氮鈉處理后細胞內(nèi)花青素的顏色變化非常緩慢，在處理5.5 min后視野中僅有少數(shù)細胞剛開始發(fā)生顏色變化；在處理長達25 min 后，細胞才開始出現(xiàn)較為明顯的藍色。這說明抑制細胞呼吸阻斷細胞內(nèi)能量供應的確能抑制鈉離子的主動運輸，進一步驗證了主動運輸過程是需要能量的。

3.3 不同呼吸抑制劑對鈉離子的跨膜運輸?shù)淖饔?呼吸抑制劑多種多樣，它們具體效果如何，哪一種又比較適合在高中生物學實驗推廣？基于上述考慮，選用了疊氮鈉、丙二酸、丙二酸鈉3 種細胞呼吸抑制劑進行比對，結(jié)果如圖3。

根據(jù)圖3 可知，加入不同類型的呼吸抑制劑后，細胞內(nèi)顏色變化的速率明顯下降，視野中發(fā)生變化的細胞數(shù)目也少了許多，這再次驗證了之前的結(jié)論：不同的抑制劑均可通過抑制細胞內(nèi)能量供應來抑制鈉離子的主動運輸。通過對比還發(fā)現(xiàn)，在這3 種呼吸抑制劑中，在丙二酸鈉組處理25 min 后，不僅視野中發(fā)生顏色變化的細胞數(shù)目最少，而且顏色變化的速率最慢，顏色也最淺，說明其抑制效果最為顯著。

綜上所述，丙二酸鈉的抑制效果最為明顯，而且相比于其他呼吸抑制劑毒性較低、更易獲取，所以最適合在高中生物學實驗中進行推廣。

4 討論與展望

本實驗從學生實際出發(fā)，以生物學科核心素養(yǎng)為基本理念進行設(shè)計，操作簡單、耗時較短，可在40 min 內(nèi)完成且成本較低，很好地幫助學生攻克主動運輸需要能量這一難點，提高了高中生物學的教學效果。

本實驗也存在一定的局限性，例如選用的呼吸抑制劑種類較少，后續(xù)可選用其他類型的呼吸抑制劑例如呼吸鏈解偶聯(lián)劑2，4-二硝基苯酚（DNP）及質(zhì)膜H+-ATPase 抑制劑釩酸鈉（Na3VO4）等繼續(xù)展開實驗。主動運輸?shù)牧硗庖粋€重要特點是需要載體蛋白的協(xié)助，故可使用特異性的載體抑制劑證明主動運輸過程需要載體的協(xié)助，進而和協(xié)助擴散進行對比，驗證協(xié)助擴散是只需要載體蛋白不需要能量，幫助學生徹底攻克物質(zhì)跨膜運輸這一難點。