杜 欣，杜少帥，馬 兵，王艷珍，陳春環(huán)，吉萬全，王長有

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制陜西科學(xué)觀測實驗站，陜西楊凌 7121003；3.楊凌國家農(nóng)作物新品種試驗站，陜西楊凌 712100)

濱麥(Leymusmollis,2n=4x=28，NsNsXmXm)是賴草屬(LeymusHochst)的一個四倍體多年生的物種，具有大穗多花、莖稈粗壯、抗旱、耐鹽堿以及對多種真菌病害表現(xiàn)免疫等優(yōu)良性狀，是小麥遺傳改良的重要三級基因源；主要分布在中國北部沿海地區(qū)、俄羅斯、朝鮮、日本和北美[1]。目前就濱麥的基因組組成爭議較大，普遍接受的基因組組成是NsNsXmXm；Ns基因組來自于新麥草屬，然而，Xm基因組的起源仍然未知[2]。研究表明，Xm基因組可能源自旱麥草的F基因組或冰草的P基因組[3]。Anamthawat-Jónsson[4]以新麥草基因組DNA作探針與賴草屬染色體進行基因組原位雜交和Southern雜交，發(fā)現(xiàn)濱麥染色體組為NsNs(Ns1Ns2)。

小麥條銹病是由條銹菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)引起的最廣泛和最具破壞性的真菌病害之一，導(dǎo)致小麥產(chǎn)量減少10%～30%甚至100%[4]。研究表明，栽培抗病小麥品種是最經(jīng)濟、有效和環(huán)保的控制條銹病的途徑[5-7]。因此，利用新種質(zhì)的抗性基因來培育抗性品種是十分有必要的，遠緣雜交是將近緣種屬中優(yōu)異的基因?qū)氲狡胀ㄐ←溨械囊环N有效方法[2]。

蘇聯(lián)育種家在20世紀(jì)50-70年代，通過胚培養(yǎng)相繼獲得了小麥-濱麥第一個雜交種、雜種的雙二倍體以及硬粒小麥與濱麥的不完全雙二倍體材料。20世紀(jì)80年代，我國育種學(xué)家將普通小麥7182與濱麥雜交，通過胚胎拯救和秋水仙素處理獲得的第一個雜交種[8]。隨后，在回交和雜交后代獲得各種衍生系，包括八倍體小濱麥和部分雙二倍體等[9]。八倍體小濱麥M842與小麥4D、5A缺體系雜交創(chuàng)制了三個附加系和兩個代換系[9-11]。兩個小麥-濱麥代換系山農(nóng)0096和山農(nóng)6343分別具有條銹病和白粉病抗性[12]。3D(3Ns)代換系10DM57，具有條銹病抗性[13]。Yang等[1]從普通小麥7182和濱麥的雜交后代中獲得三個衍生系，利用細(xì)胞學(xué)、原位雜交、分子標(biāo)記及田間抗病性鑒定等技術(shù)對小麥-濱麥衍生后代進行了分析，獲得了M42、M47、M51和7Ns(7D)代換系等[14-18]。Li等[19]將 M852-1-2-26和Norin26+3C雜交，利用GISH技術(shù)檢測其F2代植株，共獲得了具有不同染色體易位的8個單株。孫文靜等[20]對307份小濱麥種質(zhì)系苗期和成株期進行條銹病鑒定，獲得49份高抗條銹病的小濱麥種質(zhì)系，其中8份小麥-濱麥漸滲系具有大穗多花、結(jié)實性好、高抗條銹病等優(yōu)良性狀，可以作為優(yōu)異抗條銹病材料。

M11005-1-2-7-10-1-1(M11005A)是選自普通小麥7182與濱麥衍生后代M42(2n=54)F6代的株系，染色體數(shù)目為44，本研究擬通過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、原位雜交、分子標(biāo)記(EST和PLUG標(biāo)記)等方法確定M11005A外源染色體的同源群歸屬和條銹病抗性，為該種質(zhì)在小麥改良中的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為普通小麥7182、濱麥、華山新麥草、小麥-濱麥衍生后代M42、新創(chuàng)制的小麥-濱麥衍生系M11005-1-2-7-10-1-1(M11005A)和輝縣紅,均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥遠緣雜交及染色體工程實驗室提供。鑒定條銹病抗性所使用的條銹菌生理小種CYR29、CYR32、CYR34及CYR32和CYR33混合小種均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞學(xué)鑒定

在適宜的時間和溫度下在田間取供試材料的根尖和幼穗，根尖和幼穗的處理方法根據(jù)Yang等[14]方法，根尖采用卡諾氏固定液Ⅰ(V無水乙醇∶V醋酸=3∶1)室溫固定48 h,用1.0%的醋酸洋紅染色12 h，鏡檢；幼穗用卡諾氏固定液Ⅱ (V無水乙醇∶V氯仿∶V醋酸=6∶3∶1)在室溫下固定48～72 h，用1.0%的醋酸洋紅染色、壓片和鏡檢。根尖和幼穗的鏡檢均在Olympus BX-43顯微鏡下進行，分別觀察體細(xì)胞染色體數(shù)目、統(tǒng)計花粉母細(xì)胞中染色體的配對情況并進行染色體構(gòu)型分析。

1.2.2 原位雜交

(1)根尖處理：將M1005A的室內(nèi)根尖經(jīng)笑氣(N2O)處理并用1.0%果膠酶和2.0% 纖維素酶混合酶處理，用分裂相良好的染色體制片。

(2)DNA提?。焊鶕?jù)Cota-Sanchez等[21]CTAB法提取濱麥、華山新麥草、普通小麥7182及M11005A幼嫩葉片的全基因組DNA，并對用于制備基因組原位雜交探針的DNA進行純化。

(3)原位雜交：基因組原位雜交(genomicin situhybridization,GISH)鑒定利用Fu等[22]方法，分別以濱麥、華山新麥草全基因組DNA為探針與M11005A的根尖染色體進行雜交。熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)鑒定采用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2(綠色)、Oligo-pTa535(紅色)與體細(xì)胞染色體進行雜交，根據(jù)Tang等[23]方法進行。FISH-GISH同步鑒定以濱麥/華山新麥草全基因組DNA、Oligo-pSc119.2(綠色)、Oligo-pTa535(紅色)為探針同時與體細(xì)胞染色體進行雜交。用Olympus BX-53熒光顯微鏡進行觀察并用Adobe Photoshop CS6處理圖像。

1.2.3 EST-STS和PLUG標(biāo)記分析

通過分子標(biāo)記分析，根據(jù)M11005A中是否有濱麥的特異條帶來確定外源染色體同源群歸屬。本研究分別選取70對EST-STS、70對PLUG引物，分布于小麥的1～7部分同源群；其中，EST-STS引物來自網(wǎng)站http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml，PLUG引物來自Ishikawa等[24]發(fā)表的引物序列，引物均由北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(10 μL)為：1.0 μL 1×PCR Buffer(Mg2+),0.8 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs,0.8 μL 5 μmol·L-1,0.06 μL引物,5 U·μL-1Taq DNA酶,1.0 μL 100～120 ng·μL-1DNA,6.34 μL ddH2O。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸 60～90 s，32～35個循環(huán)；72 ℃終延伸5～10 min，4 ℃保存。PLUG總反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序中變性時間為45 s，60 ℃退火45 s，延伸 2 min，循環(huán)38次，其余程序與EST-STS標(biāo)記相同。PLUG的PCR產(chǎn)物用TaqI或HaeIII進行酶切[25]。PCR產(chǎn)物均用8%的變性聚丙烯酰胺膠進行電泳檢測，銀染、顯影并照相，具體參照吳金華等[26]方法。

1.2.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查

成株期調(diào)查農(nóng)藝性狀，包括株高、穗型、穗長和芒性，收獲后考察千粒重等，根據(jù)李立會等[27]方法進行。M11005A與親本間的差異顯著性通過T檢驗來檢測。

1.2.5 條銹病抗性鑒定

為了鑒定M11005A對條銹病的抗性，分別對苗期和成株期進行了小種鑒定，反應(yīng)型(IT)分為6級標(biāo)準(zhǔn)[28]，IT=0為免疫，IT=0；為近免疫，IT=1為高抗，IT=2為中抗，IT=3為中感，IT=4為高感。

(1) 苗期條銹病鑒定：苗期的抗條銹病鑒定于西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院進行，將M11005A進行分小種鑒定，以感病品種輝縣紅作為對照，分別接種CYR29、CYR32及CYR34于供試材料上，接種15 d后，輝縣紅充分發(fā)病時，記錄各材料的反應(yīng)型，3 d后重復(fù)一次。

(2)成株期條銹病鑒定：3月下旬在田間接種CYR32和CYR33的混合條銹菌菌種，將感病對照輝縣紅誘發(fā)行噴上水霧，然后將孢子均勻地抖散到鑒定植株上，5月初至上旬當(dāng)輝縣紅完全發(fā)病時，記錄鑒定材料的反應(yīng)型，7 d后重復(fù)一次。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞學(xué)鑒定

通過對M11005A的49個根尖細(xì)胞進行鏡檢，結(jié)果(圖1a)顯示，M11005A體細(xì)胞在有絲分裂中期染色體條數(shù)為44。在花粉母細(xì)胞(PMCs)的鏡檢中，觀察并統(tǒng)計了123個花粉母細(xì)胞，平均染色體配對為21.6個二價和0.8個單價，無三價體或四價體(圖1b)。在減數(shù)分裂后期I，M11005A同源染色體可以均等分離(圖1c)。說明，M11005A具有高度穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)特性，初步推測其攜帶了一對濱麥染色體。

圖1 M11005A有絲分裂中期(a)、減數(shù)分裂中期I(b)及減數(shù)分裂后期I(c)的染色體觀察

2.2 GISH、FISH及FISH-GISH鑒定

以濱麥及華山新麥草全基因組DNA作為探針，分別與M11005A根尖染色體進行原位雜交，結(jié)果(圖2)顯示，M11005A有兩條染色體被雜交上紅色信號，而其余42條染色體均呈現(xiàn)為藍色，表明M11005A附加了兩條濱麥的Ns基因組染色體。分別以O(shè)ligo-pTa535、Oligo-pSc119.2為探針與親本7182(圖3a)和M11005A根尖染色體(圖3b)進行熒光原位雜交，以濱麥或華山新麥草全基因組DNA為探針與M11005A染色體雜交，結(jié)果顯示，M11005A的42條染色體的FISH信號與親本7182的FISH信號相同，其余2條端部有相同紅色信號的染色體在7182中找不到對應(yīng)的FISH信號，推測這兩條染色體為濱麥的一對染色體，F(xiàn)ISH-GISH的結(jié)果與單獨的FISH結(jié)果一致(圖3c、圖3d)。GISH、FISH、FISH-GISH結(jié)果表明M11005A附加了一對濱麥Ns基因組的染色體。

a:以濱麥全基因組DNA(紅色)為探針與根尖染色體進行基因組原位雜交；b：以華山新麥草全基因組DNA(紅色)為探針與根尖染色體進行基因組原位雜交；箭頭所指為外源染色體(藍色為DAPI復(fù)染)。

a：以O(shè)ligo-pTa535(紅)、Oligo-pSc119.2(綠)、濱麥全基因組DNA為探針與普通小麥7182根尖染色體雜交;b：以O(shè)ligo-pTa535(紅)、Oligo-pSc119.2(綠)為探針與M11005A根尖染色體雜交;c：以O(shè)ligo-pTa535(紅)、Oligo-pSc119.2(綠)及濱麥全基因組DNA與M11005A根尖染色體雜交;d：以O(shè)ligo-pTa535(紅)、Oligo-pSc119.2(綠)及華山新麥草全基因組DNA與M11005A根尖染色體雜交;箭頭所指為外源染色體；藍色為DAPI。

2.3 分子標(biāo)記分析

利用分布在小麥1～7同源群的70個EST和70個PLUG分子標(biāo)記對M11005A中附加的兩條濱麥染色體的同源群歸屬進行分析。從中篩選出了8個EST特異標(biāo)記(BM134465、CD373475、CD454742、CD454575、BF291730、BG263365、CD452844、BE637806)和6個PLUG特異標(biāo)記(TNAC1301-TaqI/HaeIII、TNAC1326-TaqI/HaeIII、TNAC1252-TaqI、TNAC1644-TaqI/HaeIII、TNAC1286-TaqI、TNAC1291-TaqI)(表1)，以上標(biāo)記均在M11005A中擴增出了濱麥的特異性條帶(圖4和圖5)，且都位于小麥的第三部分同源群染色體上。在篩選出的這些特異標(biāo)記中，有1個 EST標(biāo)記CD452844(圖4d)、4個PLUG標(biāo)記TNAC1301-HaeIII(圖5e)、TNAC1301-TaqI(圖5f)和TNAC1326-HaeIII(圖5g)和TNAC1644-HaeIII(圖5h)均能在M11005A擴增出濱麥和華山新麥草的特異性條帶。結(jié)果表明，M11005A中附加一對濱麥第三部分同源群染色體，將其命名為Lm#3Ns，故M11005A是一個小麥-濱麥Lm#3Ns二體異附加系。

表1 M11005A中附加的濱麥第三部分同源群染色體Lm#3Ns連鎖的EST-STS及PLUG多態(tài)性標(biāo)記Table 1 EST-STS and PLUG polymorphic markers located on the third homoeologous groups applied to linkage analysis of the Lm#3Ns

M:DL2000; 1:7182; 2:濱麥; 3:M11005A; 4:華山新麥草; a: CD454742; b: CD454575; c: BF291730; d: CD452844. 箭頭為特異條帶。

2.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查

從株高、分蘗數(shù)、穗長、小穗數(shù)、小穗粒數(shù)、千粒重和芒性等農(nóng)藝性狀對M11005A、親本7182、M42的成株期進行綜合評價，結(jié)果(表2和圖6)顯示，M11005A的株高、分蘗數(shù)與親本7182和M42差異顯著，表現(xiàn)為矮稈，多分蘗；穗型、穗長、小穗數(shù)、穗粒總數(shù)及千粒重與親本7182相近，表明M11005A有矮稈、多分蘗等優(yōu)良農(nóng)藝性狀，可以作為小麥育種的中間材料。

M:DL2000; 1:7182; 2:濱麥; 3:M11005A; 4:華山新麥草. a: TNAC1326-TaqI;b: TNAC1291-TaqI; c: TNAC1252-TaqI;d: TNAC1644-TaqI; e: TNAC1301-HaeIII; f: TNAC1301-TaqI;g: TNAC1326-HaeIII; h: TNAC1644-HaeIII. 箭頭為特異條帶。

表2 M11005A,7182和M42的農(nóng)藝性狀調(diào)查Table 2 Agronomic traits of common wheat parent cultivar 7182,M42 and M11005A

2.5 苗期及成株期條銹病抗性鑒定

苗期對單個條銹菌小種CYR29、CYR32、CYR34的抗性鑒定結(jié)果(表3和圖7 )表明，對照輝縣紅發(fā)病充分，M11005A苗期對三個小種均表現(xiàn)為高感(IT=4)；親本7182除了對CYR34表現(xiàn)為中抗以外，對CYR29、CYR32分別表現(xiàn)為高感和中感；親本M42與M11005A的抗性基本相同，對CYR29均表現(xiàn)為高抗或免疫，對CYR32表現(xiàn)為中感。成株期對條銹菌混合小種CYR32和CYR33的反應(yīng)結(jié)果(圖8)表明，感病對照輝縣紅表現(xiàn)為高感(IT=4)，親本7182表現(xiàn)為中感(IT=3)，濱麥和回交親本M42表現(xiàn)為免疫(IT=0)，M11005A為高抗(IT=1)。與苗期相比，M11005A和親本M42在成株期對CYR32和CYR33混合小種表現(xiàn)為高抗，根據(jù)系譜分析，M11005A成株期對條銹病的抗性可能來源于親本M42，追溯到濱麥的第三部分同源群染色體，即濱麥Lm#3Ns染色體。因此，推測濱麥Lm#3Ns上攜帶抗條銹病基因。

表3 M11005A苗期及其親本對三種不同條銹菌小種的抗性Table 3 Identification of resistance to three different stripe rust race in the seedling stage of M11005A

a：植株；b：穗子；c：小穗及籽粒1:M42; 2:7182; 3:M11005A。

a:M11005A及其親本對CYR29條銹小種的抗性鑒定; b:M11005A及其親本對CYR32條銹小種的抗性鑒定。1：輝縣紅；2：7182； 3：M42； 4：M11005A。

3 討 論

通過GISH和FISH可以識別小麥近緣種屬與普通小麥遠緣雜交后代中的外源染色體或者小片段[29]，連續(xù)FISH-GISH可以在同一染色體制片上將外源染色體的FISH信號與GISH信號相對應(yīng)[15,17]，根據(jù)Yang等[16]的同步FISH-GISH技術(shù)，快速確定M11005A附加了一對濱麥Ns組染色體，提高了試驗的準(zhǔn)確性和效率，同時加快了對外源染色體和普通小麥染色體的識別，尤其是對易位系的鑒定。本研究通過比對M11005和親本7182的FISH核型，明確了濱麥Lm#3Ns染色體與Oligo-pTa535探針雜交的FISH核型，為今后濱麥染色體FISH核型的揭示奠定了基礎(chǔ)。

分子標(biāo)記是在小麥背景中追蹤和確定外源染色體部分同源群關(guān)系的有用工具，已經(jīng)在卵穗山羊草、冰草、濱麥、華山新麥草、簇毛麥、長穗偃麥草、黑麥等近緣種屬與小麥的衍生后代中得到廣泛應(yīng)用。通過EST及PLUG分子標(biāo)記鑒定，從普通小麥的第三個部分同源群標(biāo)記中篩選出8個EST-STS和6個PLUG標(biāo)記，其中只有1個EST和4個PLUG標(biāo)記在M11005A中均能清晰地擴增出濱麥和華山新麥草的特異性條帶，大多數(shù)EST和PLUG標(biāo)記擴增出的濱麥條帶均不同于華山新麥草。結(jié)果表明了M11005A的外源染色體為濱麥的3Ns染色體，濱麥與華山新麥草的3Ns染色體存在一定的差異，濱麥與華山新麥草Ns染色體組之間的關(guān)系還需進一步證明。這些特異的標(biāo)記可以作為一種快速、有效的工具來追蹤后代中3Ns染色體，為進一步鑒定后代中濱麥外源片段及研究濱麥的基因組組成奠定基礎(chǔ)。

1：輝縣紅； 2：7182； 3：濱麥； 4：M42； 5：M11005A。

條銹病是世界范圍內(nèi)最具毀滅性的病害之一。到目前為止，許多來自野生近緣種屬的抗條銹病基因已經(jīng)被導(dǎo)入普通小麥中[30-31]。近年來，將濱麥1～7不同部分同源群染色體的優(yōu)良基因?qū)肫胀ㄐ←溨衼硖岣呖箺l銹病等性狀，在小麥育種中發(fā)揮了重要作用[12-14,17,32]。關(guān)于小麥近緣種屬的第三部分同源群及Ns基因組的報道較多[15,17,33-35]，在小麥3AL端部滲入了長穗偃麥草3E片段的重組株系增強了小麥體內(nèi)的Na+“排斥”[36]；Kang等[37]育成了高抗條銹病的小麥-華山新麥草漸滲系T3BL-3NsS；多重代換系05DM6有三對Ns染色體具有高抗條銹病特性[38]；小麥-華山新麥草二體異附加系3Ns具有高抗條銹病[7]；Pang等[13]創(chuàng)制了抗葉銹病的小麥-濱麥二體異代換系3D(3Ns#1)；小麥-濱麥第三同源群單體附加系具有高抗條銹病特性[39]。本研究中，M11005A在苗期時與親本M42對小種CYR29及CYR34都表現(xiàn)出良好的抗性，而親本7182對CYR29卻表現(xiàn)為高感，對CYR34表現(xiàn)為中抗，推測M11005A的3Ns染色體上可能攜帶了對條銹菌小種CYR29的抗性基因；M11005A與親本M42在苗期對CYR32表現(xiàn)為中感。在成株期，二者對CYR32和CYR33的混合小種分別表現(xiàn)為高抗和免疫，由此可以推測3Ns染色體上攜帶了對CYR32和CYR33小種的成株期抗性基因。推測小麥近緣種屬第三部分同源群上攜帶了諸多可以用于改良小麥的基因。

二體異附加系不僅為研究物種的起源和進化、染色體同源關(guān)系、基因定位、基因克隆、基因表達和相互作用提供了橋梁，而且還可以用于創(chuàng)制外源染色體代換系和易位系[40]。與附加系和代換系相比，因為小片段易位系可以被直接利用，因此育種家更傾向于易位系的創(chuàng)制和利用[41]。Fu等[42]創(chuàng)制了綿陽11和4R二倍體小麥-黑麥T4RS-5DS·5DL和T5DS-4RS·4RL易位系。Du 等[43]從黑麥的6RLKu微染色體中創(chuàng)制了小麥-黑麥6D/6RLku的小片段易位系。Zhang等[44]利用具有高抗條銹病的中國春-簇毛麥3V附加系和普通小麥中國春雜交產(chǎn)生了小麥-簇毛麥高抗條銹病滲入系CD-3。利用60Coγ輻射[45]，殺配子染色體[46]和中國春ph1b[32]能有效地引起染色體變異。M11005A的多分蘗、矮稈、抗條銹病等優(yōu)良性狀，具有改良小麥育種的應(yīng)用潛力，因此可以通過上述方法對M11005A進行處理，用來創(chuàng)制具有抗條銹病基因的漸滲系或小片段易位系，并通過連續(xù)回交和自交，以獲得高抗條銹病等優(yōu)良性狀的新種質(zhì)。