張 瑞，秦永亮，李 姣，郭玉楷，吳 欣，李永軍

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊 050000

近年來的流行病學(xué)研究表明，一些植物來源化學(xué)成分的攝入水平與腫瘤、感染的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。這些成分因?yàn)榫哂懈咝?、低毒的特性而備受關(guān)注。白藜蘆醇是虎杖的有效成分之一，是一種天然多酚化合物，具有廣泛的藥理活性，生物利用度較高。紅葡萄皮中有高水平的白藜蘆醇。本課題組的前期研究表明，白藜蘆醇具有一定的抗白念珠菌活性，但其作用機(jī)制不詳[2]。有研究表明，白藜蘆醇可通過誘導(dǎo)真菌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗菌作用[3]。本研究探討了白藜蘆醇通過誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗白念珠菌活性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1菌株 白念珠菌ATCC 90028，由北京協(xié)和醫(yī)院惠贈(zèng)。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱為上海博迅公司產(chǎn)品。

1.2.2試劑 白藜蘆醇購自Sigma公司，兩性霉素B(AmB)購自Solarbio公司。PBS緩沖液pH值為7.0；RPMI-1640培養(yǎng)基為Solarbio公司產(chǎn)品；蝸牛酶為Solarbio公司產(chǎn)品；Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒為凱基公司產(chǎn)品；活性氧檢測試劑盒為Solarbio公司產(chǎn)品；線粒體膜電位(MMP)檢測試劑盒為Solarbio公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1菌株的活化及菌液配制 從4 ℃保存的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)上挑取白念珠菌ATCC 90028單菌落接種于沙氏液體培養(yǎng)基中，35 ℃搖床振蕩(200 r/min)過夜培養(yǎng)，使菌株處于對數(shù)生長期，離心收集菌體，PBS洗滌兩次后，用RPMI-1640稀釋至2×106CFU/mL備用[4]。

1.3.2菌株的凋亡誘導(dǎo) 將2 mL指數(shù)生長期(A600=0.5)的白念珠菌懸液(密度為2×106CFU/mL)接種于24孔培養(yǎng)板中，同時(shí)將白藜蘆醇分別加入孔板中，使終濃度分別為0.256、0.128、0.064 mg/mL，另設(shè)不加藥的空白對照組和加AmB(終濃度為0.5 μg/mL)的陽性對照組。37 ℃靜置孵育2 h，離心后無菌PBS洗3次，然后用Annexin Ⅴ-FITC和PI的標(biāo)記液混勻(密度為106CFU/mL)。室溫避光37 ℃孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3.3白藜蘆醇對白念珠菌活性氧(ROS)的影響 對指數(shù)生長期的白念珠菌懸液進(jìn)行不同的加藥處理后(同1.3.2)，37 ℃孵育12 h，離心收集白念珠菌細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌3次后調(diào)整密度為5×106CFU/mL。利用探針2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)進(jìn)行ROS檢測，DCFH-DA可自由通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解，而DCFH則不能透過細(xì)胞膜，從而使探針易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF熒光即可得知細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。按照試劑盒說明加入DCFH-DA試劑，37 ℃孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測白念珠菌ROS水平[5]。

1.3.4白藜蘆醇對白念珠菌MMP的影響 對指數(shù)生長期的白念珠菌懸液進(jìn)行不同的加藥處理后(同1.3.2)，孵育、離心收集白念珠菌細(xì)胞、PBS緩沖液洗滌、調(diào)整濃度同1.3.3。JC-1為檢測MMP的熒光探針。當(dāng)MMP較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光；而MMP較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，產(chǎn)生綠色熒光。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變(紅色和綠色熒光強(qiáng)度的比值)可反映細(xì)胞膜電位的變化。參照MMP檢測試劑盒說明書加入JC-1染色工作液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱30 ℃避光孵育15 min后，PBS洗滌3次，用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度[6]，然后計(jì)算。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1白藜蘆醇對白念珠菌細(xì)胞凋亡的影響 在0.064～0.256 mg/mL范圍內(nèi)，隨著白藜蘆醇濃度的升高，白念珠菌細(xì)胞凋亡率逐漸升高，見圖1。

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

2.2白藜蘆醇對白念珠菌ROS陽性率的影響 空白對照組的熒光強(qiáng)度弱，ROS陽性率為0.8%，不同濃度白藜蘆醇(0.064、0.128、0.256 mg/mL)處理后，熒光強(qiáng)度呈劑量依賴性增強(qiáng)，ROS陽性率分別提升至1.9%、5.1%、8.7%和16.4%，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

2.3白藜蘆醇對白念珠菌MMP的影響 與空白對照組比較，不同濃度(0.064、0.128、0.256 mg/mL)白藜蘆醇可顯著降低白念珠菌MMP，紅色和綠色熒光強(qiáng)度比值分別為2.14、1.86、1.64(P<0.05)，見圖3。

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

3.1白藜蘆醇誘導(dǎo)白念珠菌凋亡的機(jī)制 細(xì)胞凋亡是生物體普遍存在的現(xiàn)象——細(xì)胞自主有序的死亡過程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對真菌研究有重要意義。在所有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素中，凋亡的早期表現(xiàn)之一為MMP的下降[7-8]。線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生的中心場所，對維持細(xì)胞能量代謝和正常功能起重要作用，誘發(fā)凋亡的因素會導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放激活caspase，破壞電子傳遞，降低MMP參與調(diào)節(jié)等[9]。若MMP耗盡，細(xì)胞將進(jìn)入不可逆的凋亡轉(zhuǎn)歸途徑[10]。在凋亡信號的刺激下，細(xì)胞凋亡導(dǎo)致一系列損傷相關(guān)的異質(zhì)性分子的釋放，如線粒體DNA、ROS、n-甲酰化肽及心磷脂，導(dǎo)致細(xì)胞通透性會增加[11-12]。作為酵母菌屬細(xì)胞凋亡中的第二信使--不同水平的ROS決定了細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸途徑，包括凋亡、壞死、凋亡轉(zhuǎn)變壞死等[13-14]。

壞死及凋亡細(xì)胞均釋放具有炎癥特性的線粒體，以往的研究表明白藜蘆醇可通過阻滯細(xì)胞S期從而影響白念珠菌的活性[15]。本實(shí)驗(yàn)采用FCFH-DA和JC-1熒光試劑，檢測白念珠菌ROS和MMP水平。白藜蘆醇的作用機(jī)制可能與降低白念珠菌的MMP水平、提高ROS水平、擾亂線粒體功能等凋亡進(jìn)展中與線粒體損傷有關(guān)的進(jìn)程有關(guān)。

3.2白藜蘆醇誘導(dǎo)白念珠菌凋亡的意義 白念珠菌常存在于人類上呼吸道、口腔、腸道及陰道等黏膜腔中，是臨床上重要的條件致病菌[16-18]。臨床上的治療主要采用AmB及唑類抗真菌藥物，其長期應(yīng)用引起不良反應(yīng)的報(bào)道日益增多[19]，因此尋找和發(fā)現(xiàn)新的藥物以抑制白念珠菌的活性成為亟待解決的問題之一。白藜蘆醇作為近年中藥研究中的熱點(diǎn)，其廣泛的生物學(xué)活性受到關(guān)注。本研究中通過測定不同加藥處理組白念珠菌的ROS、MMP水平，證實(shí)了白藜蘆醇具有誘導(dǎo)白念珠菌凋亡的作用，中藥成分誘導(dǎo)念珠菌屬凋亡是當(dāng)今抗真菌治療的新策略，為臨床治療白念珠菌感染提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3.3相關(guān)研究的比較 WEBER等[20]研究證明，白藜蘆醇對于常見的念珠菌屬并未有明顯的抑制作用，而有報(bào)道指出白藜蘆醇衍生物可能影響念珠菌屬[21]。LEE等[3]的研究證實(shí)白藜蘆醇可誘導(dǎo)白念珠菌的凋亡。

3.4本研究的局限性 本實(shí)驗(yàn)中選取白念珠菌ATCC90028的標(biāo)準(zhǔn)株作為研究對象，結(jié)果尚有代表性，但還需大樣本的臨床分離株及動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)做進(jìn)一步的證實(shí)；其次，在研究方法方面除了用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測外，還應(yīng)該結(jié)合其他分子水平的實(shí)驗(yàn)來對凋亡機(jī)制進(jìn)行深入分析。

綜上所述，白藜蘆醇可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮對白念珠菌的抑制作用，為白藜蘆醇用于臨床治療白念珠菌感染提供了有效的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，進(jìn)一步豐富了中藥抗真菌的理論，但其更深入的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。