李凱 宮一瑋 李興康 張艷婷 Maurycy Daroch 金鵬

不同光質(zhì)對嗜熱藍細菌Synechococcus sp.PCC6715生長的影響

李凱 宮一瑋 李興康 張艷婷 Maurycy Daroch 金鵬?

北京大學(xué)深圳研究生院環(huán)境與能源學(xué)院, 深圳 518055; ?通信作者, E-mail: jinpeng@pkusz.edu.cn

使用光合有效光量子數(shù)密度(PAR)均為 100μmol/(m2?s)的白光(對照)、紅光和藍光, 對對數(shù)生長期的嗜熱藍細菌進行培養(yǎng), 以期探明不同光質(zhì)對不表達藻紅素的藍細菌光適應(yīng)生長的影響。結(jié)果表明, 在不同光質(zhì)培養(yǎng)對數(shù)生長期的過程中, 與白光相比, 干重在藍光下明顯增加, 紅光下明顯減少; 紅、藍光質(zhì)對光合色素合成產(chǎn)生影響的開始時間和持續(xù)時間有所不同; 最大光能轉(zhuǎn)化效率(v/m)在藍光下明顯提高, 紅光下明顯降低, 培養(yǎng) 6 天后, 紅、藍光條件下的v/m均趨于穩(wěn)定。藍光有利于的生長, 紅光不利于的生長; 同時,在紅、藍光質(zhì)中均產(chǎn)生適應(yīng)性生長, 藻藍素的減少使在紅光中發(fā)生適應(yīng)性生長, 藍光中發(fā)生適應(yīng)性生長是由于藻藍素的增加。

藍細菌; 嗜熱藍細菌; 光質(zhì); 光適應(yīng)生長; 藻藍素

嗜熱藍細菌分離于 45oC 以上的溫泉地帶, 是2000 余種藍細菌的重要組成菌種[1–2]。藍細菌不僅對水體生態(tài)系統(tǒng)的維持有重要作用, 而且遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn), 嗜熱藍細菌的存在是地球上能夠出現(xiàn)其他生命體的重要原因[3–6]。藍細菌是地球上重要的初級生產(chǎn)力, 環(huán)境中的光質(zhì)和光強對其合成有機物的能力具有決定性的影響[4,7–9]。

近年來, 對嗜熱藍細菌的研究受到極大的關(guān)注。Liang 等[10]得到嗜熱藍細菌捕光色素蛋白質(zhì)在不同溫度和 pH 條件下的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。Eberly 等[11]通過測定嗜熱藍細菌在不同 CO2濃度中的生長狀況, 評估嗜熱藍細菌作為工業(yè)排放 CO2的主要治理方式的可能性。Nikolova 等[12]和 Pedersen 等[13]研究嗜熱藍細菌對溫度產(chǎn)生適應(yīng)時, 承擔光合作用相關(guān)組分的變化情況。MacColl[14]及 Wiltbank 等[4]等從光適應(yīng)性生長的觀點出發(fā), 總結(jié)在不同光質(zhì)條件下表達藻紅素的藍細菌生長發(fā)生變化的原因。這些研究為嗜熱藍細菌對環(huán)境要素的響應(yīng)提供了依據(jù), 但對藍細菌光適應(yīng)性生長的機理研究仍有不足之處, 相關(guān)研究以表達藻紅素的藍細菌為主, 對不表達藻紅素的藍細菌研究明顯不足[15]。由于藍細菌光適應(yīng)性生長研究的局限, 可能會限制藍細菌光適應(yīng)生長研究成果的工程應(yīng)用范圍。

為補充對不表達藻紅素的藍細菌光適應(yīng)生長的研究, 本文以 Liang 等[10]通過系統(tǒng)發(fā)育樹方法鑒定出的不表達藻紅素的對數(shù)生長期的嗜熱藍細菌為對象, 研究其在不同光質(zhì)培養(yǎng)過程中的生長變化情況。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)與光源設(shè)計

購自德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校的藻類培養(yǎng)中心, 由北京大學(xué)深圳研究生院環(huán)境與能源學(xué)院環(huán)境生物能源實驗室進行擴大培養(yǎng), 具體步驟如下: 將購買的藻種按照 1:5 (藻種:BG11 培養(yǎng)基)進行稀釋, 在有效光子數(shù)密度(PAR)為 100μmol/(m2·s)的白色 LED 光源(Ra=70)、光暗比=16 h : 8 h、45oC 恒溫搖床、150 r/min 的條件下進行培養(yǎng), 待其生長至穩(wěn)定期后, 將此時的藻種在相同的培養(yǎng)條件下進行第二次稀釋培養(yǎng), 待其生長至對數(shù)生長初期時, 取第二次生長到對數(shù)生長初期的藻種, 將其稀釋到OD730nm=0.09 左右, 在如圖 1 所示特征的藍光(454nm, Ra=68)、紅光(654nm, Ra=70)和白光(6500K, 400~700nm)中連續(xù)培養(yǎng) 7 天, 每種光質(zhì)條件下設(shè)置 3 組獨立的平行實驗組。

1.2 培養(yǎng)基

配制 BG-11 培養(yǎng)基[1], 使用 HCl 或 NaOH 將培養(yǎng)基的 pH 調(diào)整至 7.1 左右, 121oC 滅菌 30 分鐘, 室溫冷卻后, 4oC冷藏備用。

1.3 干重測定

通過測定藻種的干重確定生長狀況。取 10mL藻液, 在 4000r/min 的條件下離心 10 分鐘, 棄上清液, 置于凍干機中 24 小時, 計算凍干處理前后的質(zhì)量差值, 即為藻種的干重。

1.4 葉綠素 a 與類胡蘿卜素測定

取 1mL 菌株培養(yǎng)懸浮液, 在 4oC 條件下以15000離心 7 分鐘, 小心移去上清液, 加入 1mL預(yù)冷至 4oC 的甲醇, 混勻樣品后, 使用鋁箔紙覆蓋, 在 4oC 冰箱孵育 20 分鐘以提取來自細胞的色素, 孵育完成后, 以 15000, 4oC 的超速離心機中離心 7 分鐘, 以甲醇作為空白校準分光光度計, 分別測定上清液與空白對照在 470, 665 和 720nm 處的吸光度。根據(jù)下式計算色素含量:

Chl.a(μg/mL)=12.9447(OD665nm?OD720nm) , (1)

1.5 藻膽素測定

取 10mL 菌液, 以 4000r/min 的轉(zhuǎn)速在 4oC 離心 15 分鐘, 去上清液, 加入磷酸鹽緩沖液(0.5mol/ L, pH=7.0)混合均勻, 用超聲細胞破碎機破碎細胞3 分鐘, 超聲細胞破碎機的設(shè)置為輸出 9 秒, 占空比65%。破碎完成后, 以 15000的速度在 4oC 超速離心機中離心 7 分鐘, 上層清液即為含藻膽素的提取液。整個過程盡量在黑暗環(huán)境中進行, 在冰上操作以避免高溫的影響。通過分光光度計測量 615, 652和 562nm 處的吸光度, 根據(jù)文獻[16]中公式計算藻膽蛋白含量。

1.6 最大光能利用效率(Fv/Fm)的測定

使用 1mL 移液槍, 準確地移取 2mL 藻液, 在黑暗處靜置 1 小時, 然后使用葉綠素?zé)晒鈨x, 在 10μmol/(m2?s)的 620nm 波段的紅光條件下測得光合系統(tǒng)的初始熒光0, 在 210μmol/ (m2?s)的 620nm波段的紅光條件下測得光合系統(tǒng)的最大熒光m, 最大光能利用效率的測定公式為

v=m?0, (3)

y=v/m。 (4)

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究使用 Excel 2010 計算實驗數(shù)據(jù), 使用Graphpad Prism5.0 軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)對嗜熱藍細菌PCC6715 的干重影響

在不同光質(zhì)的培養(yǎng)過程中, 對照組與實驗組中的干重均呈增加的趨勢(圖 2)。與對照組白光相比,的干重在藍光下較高, 紅光下較低。相對于白光, 藍光對的生長有顯著的促進作用, 紅光不利于對數(shù)生長期的生長。

2.2 不同光質(zhì)對嗜熱藍細菌 PCC6715 的光合色素及Fv/Fm的影響

的光合色素含量在不同光質(zhì)中均呈現(xiàn)上升趨勢, 最大光能轉(zhuǎn)化效率均呈現(xiàn)先增加、后趨于穩(wěn)定的趨勢。葉綠素 a 含量的變化如圖3(a)所示, 與白光對照組相比,在藍光培養(yǎng)過程中葉綠素 a 含量明顯升高, 紅光條件下生長至第 5 天時葉綠素 a 含量才開始顯著降低; 與紅光相比, 藍光對葉綠素 a 的合成產(chǎn)生影響的時間更早, 且持續(xù)時間更長。圖 3(b)顯示在不同光質(zhì)培養(yǎng)下藻膽素含量的變化, 與白光相比,藻膽素的含量在藍光下始終較高, 在紅光下的含量從第 6 天開始出現(xiàn)明顯的減少; 與紅光相比, 藍光對藻膽素的合成產(chǎn)生影響的時間更早, 且持續(xù)時間更長。不同光質(zhì)條件下的v/m變化如圖 3(c)所示, 與白光對照組相比,的最大光能轉(zhuǎn)化效率在藍光培養(yǎng)下明顯升高, 在紅光條件下明顯下降; 但是, 在不同光質(zhì)培養(yǎng)過程中,的最大光能轉(zhuǎn)化效率都表現(xiàn)出先增加、后歸于平穩(wěn)的變化趨勢。圖 3(d)顯示不同光質(zhì)中生長過程中類胡蘿卜素含量的變化, 與白光相比,類胡蘿卜素含量在藍光條件下培養(yǎng)至第 7 天開始明顯地增多, 而在紅光條件下從第 3 天即開始明顯地降低; 與紅光相比, 藍光對類胡蘿卜素的合成產(chǎn)生影響的時間較晚。

2.3 不同光質(zhì)對嗜熱藍細菌 PCC6715 捕光色素的影響

對進行全光譜掃描, 確定其光合色素的組成種類, 結(jié)果如圖 4(a)所示。的光合色素由葉綠素 a (吸收峰 435 和 675nm)、類胡蘿卜素(吸收峰 490nm)以及捕光色素?藻藍素(吸收峰 625nm)和別藻藍素(吸收峰 650nm)共同構(gòu)成。對不同光質(zhì)藻藍素和別藻藍素相對含量的測定結(jié)果見圖 4(b)。在白光、紅光和藍光中,別藻藍素和藻藍素的相對含量均降低; 與白光相比, 在藍光條件的整個培養(yǎng)過程中別藻藍素和藻藍素的相對含量均顯著降低, 在紅光培養(yǎng)的第2, 4, 6 和 7 天明顯升高;中別藻藍素和藻藍素的相對含量在白光、藍光與紅光條件下培養(yǎng) 6 天后都趨于穩(wěn)定。對在不同光質(zhì)中別藻藍素含量的測定結(jié)果見圖 4(c)。與白光對照組相比,的別藻藍素含量在紅光和藍光中無顯著變化。在不同光質(zhì)中藻藍素含量的測定結(jié)果見圖 4(d)。與白光相比,藻藍素的含量在藍光條件下始終較高, 在紅光條件下培養(yǎng)至第 6 天明顯減少; 與紅光相比, 藍光對藻藍素的合成產(chǎn)生影響的時間更早, 且持續(xù)時間更長。

3 討論與結(jié)論

植物及藻類的干重反映其凈光合作用的大小[17], 植物及藻類通過由光合反應(yīng)中心色素與捕光色素共同組成的光合色素進行光合作用, 捕光色素將捕獲到的 95%以上的光能傳遞至光合反應(yīng)中心[18], 光合反應(yīng)中心在利用光能時產(chǎn)生葉綠素?zé)晒猬F(xiàn)象, 由光合反應(yīng)中心葉綠素?zé)晒猬F(xiàn)象獲得的最大光能利用效率直接反映植物及藻類光合作用過程中發(fā)生的變化[19]。

本實驗中,的干重在藍光處理組中始終高于紅光處理組, 實驗結(jié)果與劉洪艷等[20]和韓軍軍[21]關(guān)于不同光質(zhì)對藍、紅藻生長影響的實驗結(jié)果相似。葉綠素 a、類胡蘿卜素和藻膽素共同構(gòu)成嗜熱藍細菌的光合色素[3]。雖然在培養(yǎng)過程中, 藍光條件下的光合色素總量高于紅光條件下, 但由于紅、藍光對不同色素開始產(chǎn)生影響的時間或影響持續(xù)的時間不同, 所以在紅、藍光質(zhì)中的干重差異不僅僅取決于光合色素的總量差異。另外, 最大光能利用效率代表光合系統(tǒng)對光能的利用效率, 由于藍光條件下的最大光能利用效率始終大于紅光培養(yǎng)條件下, 所以最大光能利用效率也是導(dǎo)致在不同光質(zhì)中差異生長的重要原因。

藍細菌通過調(diào)整自身捕光色素的相對含量來實現(xiàn)在不同波長光照下的生長, 這一現(xiàn)象稱為光適應(yīng)生長[22]。最大光能利用效率不僅反映藻類在所處環(huán)境中的生長狀態(tài), 同時, 如果在培養(yǎng)環(huán)境中藻類出現(xiàn)最大光能利用效率發(fā)生變化但最終趨于穩(wěn)定的現(xiàn)象, 則說明藻類在該培養(yǎng)環(huán)境中發(fā)生了適應(yīng)性生長[23–24]。對含藻紅素的藍藻是否發(fā)生光適應(yīng)性的判定依據(jù)是, 藻紅素與藻藍素的相對含量是否發(fā)生變化[25], 但對不含藻紅素的藍細菌發(fā)生光適應(yīng)性的機制研究尚無定論。對于含有藻紅素的藍藻和紅藻, 光能的捕獲和傳遞具有嚴格的方向性, 首先由藻紅素捕獲光能, 并將捕獲的 95%以上的能量傳遞至藻藍素, 藻藍素再將從藻紅素獲取的 95%的能量傳遞至別藻藍素, 別藻藍素再將從藻藍素獲取的95%的能量傳遞到光合反應(yīng)中心[26]。雖然屬于不含藻紅素的藍細菌, 但由于藍細菌中光能捕獲結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性, 所以能量捕獲和傳遞的方向性在中依然適用。本實驗中的最大光能利用效率在藍、紅光條件下培養(yǎng)至第 6 天時結(jié)束波動變化, 并趨于穩(wěn)定, 表明在藍、紅光中產(chǎn)生光適應(yīng)性生長。作為的捕光色素,的別藻藍素與藻藍素相對含量經(jīng)藍、紅光處理 6 天后基本上不再發(fā)生變化, 說明對數(shù)生長期通過調(diào)整別藻藍素與藻藍素的含量以適應(yīng)不同的光質(zhì)。通過對在藍、紅光中別藻藍素與藻藍素的含量分析, 我們發(fā)現(xiàn)別藻藍素的含量在藍、紅光中基本上一致;藻藍素的含量在藍光中明顯高于紅光中。

綜上所述, 如圖 5 所示,通過調(diào)整捕光色素的含量在藍、紅光中產(chǎn)生適應(yīng)性生長, 藻藍素含量的改變是引發(fā)在藍、紅光下產(chǎn)生光適應(yīng)性生長的主要原因。

本實驗在不同光質(zhì)條件下處理, 得到其在不同光質(zhì)中生長的差異, 探究不含藻紅素的藍細菌產(chǎn)生光適應(yīng)生長的原因。為了進一步明晰不表達藻紅素的嗜熱藍細菌在藍、紅光質(zhì)中產(chǎn)生適應(yīng)性生長時基因表達的變化, 下一步還需以基因工程為手段, 運用基因組學(xué)進行深入的研究。

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Effects of Different Light Qualities on the Growth of Thermophilic Cyanobacteriasp.

LI Kai, GONG Yiwei, LI Xingkang, ZHANG Yanting, Maurycy Daroch, JIN Peng?

School of Environment and Energy, Peking University Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055; ? Corresponding author, E-mail: jinpeng@pkusz.edu.cn

In order to understand the lighting quality effects on the light-adaptive growth of cyanobacteria which does not express phycoerythrin, the thermophilic cyanobacteriain logarithmic growth phase was cultured by using white light (control), red light, and blue light with photosynthetically effective photon quantum density (PAR) of 100 μmol/(m2?s). Compared with the growth characteristics ofunder white light conditions, the changes in the measured and analyzed values ofunder other light qualities were as follows:the dry weight ofsignificantly increased under blue light and significantly reduced under red light; the red and blue light have different effects on the start time and duration of the photosynthetic pigment synthesis of; the maximum light energy conversion efficiency (v/m) ofsignificantly increased under blue light and decreased significantly under red light; after 6 days of culture, thev/mofunder red and blue light conditions tends to stable. In conclusion, the blue spectrum lighting promotes the growth of, while red light inhibits the growth of. At the same time,produces light-adaptive growth under both red and blue light, the reduction of phycocyanin content caused light-adaptive growth ofin red light, and the light-adaptive growth ofin blue light was due to the increase of phycocyanin content.

cyanobacteria; thermophilic cyanobacteria; light quality; light-adaptive growth; phycocyanin

10.13209/j.0479-8023.2020.036

深圳市協(xié)同創(chuàng)新計劃國際合作研究項目(GJHZ20180928162210431)資助

2019–04–28;

2020–04–07