周慧君, 魏翠華, 謝 宇, 陳芳蘭, 陳 沁, 曾 凡

(福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 福州 350018)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)珍稀植物[1-4]，素有“九大仙草”之首的美稱[5]。其主要成分為多糖，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力等功效[6-7]，還含有菲類化合物、生物堿、氨基酸等成分[8]，廣泛應(yīng)用于日常保健和疾病治療。由于特殊的花器官構(gòu)造，野生鐵皮石斛結(jié)實率較低，且因其種子為無胚乳結(jié)構(gòu)，使得發(fā)芽率低于3%[9]，加之人為濫采挖，造成野生資源瀕臨枯竭。當(dāng)前市售鐵皮石斛多為人工種植，可利用人工授粉提高鐵皮石斛的授粉率[10]，再通過無菌播種縮短其生長周期。目前，有關(guān)鐵皮石斛的研究多集中于品質(zhì)影響因素分析[11-14]、化學(xué)成分的分析和提取[15-18]、親緣關(guān)系的研究及雜交后代的分子鑒定[19-22]等方面。有關(guān)福建省鐵皮石斛種質(zhì)資源分析[23]及自花、異花授粉的雜交育種快繁技術(shù)[24]已見報道，但少有鐵皮石斛多種質(zhì)間的授粉方式及蒴果發(fā)育的相關(guān)研究。為了對福建省鐵皮石斛資源進(jìn)行品種創(chuàng)新，緩解野生資源壓力，本研究對福建省適種的5個鐵皮石斛種質(zhì)進(jìn)行不同授粉方式和授粉時間的試驗，并研究了蒴果的發(fā)育情況，以期為鐵皮石斛的繁育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料來源于福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所溫室大棚，引進(jìn)的優(yōu)良種質(zhì)經(jīng)過適應(yīng)性栽培后，選擇生長較好且有代表性的種質(zhì)。參試的5個種質(zhì)(TF、TZ、TA、TY、TD)分別來源于福建、浙江、安徽、云南、廣東等地，均為農(nóng)家品種。每個種質(zhì)均挑選枝條較為粗壯、生長相近的6～9盆植株作為試驗對象。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 結(jié)實率 盛花期挑選開花后2～3 d的鐵皮石斛，參照王聰?shù)萚25]的方法，各種質(zhì)分別選取6盆植株進(jìn)行自花授粉、同株異花授粉、種質(zhì)內(nèi)異株授粉及種質(zhì)間授粉。其中，自花授粉指用本花朵的花粉塊進(jìn)行授粉；同株異花授粉為同株不同花朵間授粉；種質(zhì)內(nèi)異株授粉表示同一種質(zhì)不同植株的花朵間授粉；種質(zhì)間授粉為不同種質(zhì)的花朵間授粉。授粉時去掉唇瓣，用牙簽挑取花粉塊放置柱頭上。每授粉1次對牙簽進(jìn)行消毒或更換牙簽，并及時掛牌標(biāo)注授粉日期、授粉朵數(shù)等。授粉1個月后統(tǒng)計結(jié)實率。結(jié)實率/%=(結(jié)實個數(shù)/授粉花朵數(shù))×100。

1.2.2 座果率 根據(jù)開花特性選取開花較集中、量大且長勢健壯的鐵皮石斛TF、TZ、TA種質(zhì)各3盆。用標(biāo)簽標(biāo)注好花朵完全開放的日期。開花后1～6 d內(nèi)進(jìn)行種質(zhì)間授粉，每天授粉25～30朵，授粉后及時掛牌并做好記錄。采收時統(tǒng)計座果率。座果率/%=(采收蒴果個數(shù)/授粉花朵個數(shù))×100。

1.2.3 蒴果形態(tài)變化 (1)隨機(jī)選取TY、TA、TF、TZ種質(zhì)經(jīng)不同授粉方式后所得蒴果為觀測對象，分別于授粉后第5天起用直尺和游標(biāo)卡尺分別測量錄果莢的長度和寬度，授粉后第10天第2次測定，之后每10 d觀測并記錄數(shù)據(jù)，直至授粉100 d。授粉100 d后統(tǒng)計并分析蒴果發(fā)育情況。(2)隨機(jī)選取經(jīng)種質(zhì)間授粉的TA、TF、TZ種質(zhì)，于授粉后90～210 d進(jìn)行成熟度試驗。解剖果莢并混合種子后，在生物顯微鏡(10×)下觀察種子形態(tài)。部分混合后的種子經(jīng)TTC染色后，在顯微鏡(4×)下觀察染色情況，紅色則為有胚種子，統(tǒng)計視野內(nèi)有胚種子個數(shù)和種子的總個數(shù)，3次重復(fù)，并計算種子的有胚率。有胚率/%=(有胚種子個數(shù)/種子總個數(shù))×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 授粉方式對鐵皮石斛結(jié)實率的影響

授粉方式對鐵皮石斛結(jié)實率的影響見表1。由表1可以看出，5個種質(zhì)均不能進(jìn)行自花授粉和同株異花授粉，結(jié)實率均為0。各種質(zhì)間授粉和種質(zhì)內(nèi)異株授粉均能成功獲得蒴果，但種質(zhì)間授粉結(jié)實率(87.50%～98.67%)高于種質(zhì)內(nèi)異株授粉(62.50%～77.78%)，說明鐵皮石斛存在自交不親和性且有較高的雜交親和性，能夠通過種質(zhì)間授粉獲得大量蒴果。5個種質(zhì)的平均結(jié)實率分別為82.64%、83.39%、78.80%、86.20%、80.59%，可見不同種質(zhì)的結(jié)實率存在差異，在后續(xù)的雜交育種組配中選擇結(jié)實率較高的種質(zhì)作為父母本能獲得更多的雜交后代。

表1 不同授粉方式下鐵皮石斛的結(jié)實率Table 1 Seed setting rate of D.officinale by different pollination methods

2.2 授粉時間對鐵皮石斛座果率的影響

授粉時間對鐵皮石斛座果率的影響見圖1。由圖1可知，鐵皮石斛開花后6 d內(nèi)授粉都能結(jié)果，座果率均在80%以上。在開花后2～3 d授粉，座果率最高，達(dá)100%，分別比開花后1 、4 、5和6 d高14%、11.11%、14.29%和20%。說明開花后2～3 d為最佳授粉時間，此時花粉成熟、柱頭粘性較大，有利于提高座果率；開花后4～6 d授粉座果率逐漸下降，可能跟柱頭粘性變差有關(guān)。

2.3 授粉時間對鐵皮石斛蒴果及種子的影響

2.3.1 蒴果 鐵皮石斛盛花期一般在4—5月，其蒴果近橢圓形，主要經(jīng)人工授粉后獲得。蒴果生長期可達(dá)6～7個月，果莢表面最初為翠綠色、有光澤，種子為深黃色結(jié)塊狀態(tài)，逐步變?yōu)楸砻纥S色、稍微疲軟的成熟蒴果，此時種子呈粉末分散狀[26]。授粉成功的花朵會在授粉2～3 d后萎縮，第4天子房開始膨大，之后膨大逐漸明顯。授粉0～100 d鐵皮石斛蒴果生長曲線見圖2。由圖2可知，授粉5～30 d鐵皮石斛蒴果快速生長，果莢長度和寬度增長快速；授粉30～60 d果莢長度進(jìn)入緩慢增長階段，而果莢寬度增長速度明顯快于長度；授粉60 d，果莢生長趨于平穩(wěn)，蒴果大小基本穩(wěn)定。

2.3.2 種子 鐵皮石斛種子黃色、較小，具種皮和種胚；呈紡錘形，兩端漸狹，中部膨大，種胚位于種子中間膨大部分，為黃綠色。解剖成熟蒴果，并統(tǒng)計種子總數(shù)，約在5.3～23.6萬粒之間。不同成熟度的蒴果解剖后種子形態(tài)見圖3。授粉90 d，種子結(jié)塊呈粘連狀態(tài)，不易抖落；授粉120 d，部分種子為粉塵狀且能少量抖落，但大部分還是結(jié)塊粘連；授粉150～210 d，種子呈粉塵狀且可以快速抖落，而粉狀種子更適合作為無菌播種的原材料。顯微鏡下種子形態(tài)及染色情況見圖4，在顯微鏡(10×)下，鐵皮石斛種子構(gòu)造簡單，僅由1層透明的種皮和1個種胚構(gòu)成，無胚乳。在顯微鏡(4×)下觀察TTC染色后的種子，統(tǒng)計種子個數(shù)并計算種子有胚率發(fā)現(xiàn)，授粉90 d蒴果種子有胚率為81.16%，與其他天數(shù)差異顯著，授粉120、150、180、210 d種子有胚率分別為96.62%、94.59%、94.50%和91.58%，均在90%以上，經(jīng)SPSS方差分析差異均不顯著。綜合來看，以授粉150 d左右的種子進(jìn)行無菌播種最佳。

3 討論與結(jié)論

本試驗通過引種各地具有優(yōu)良性狀的農(nóng)家品種經(jīng)適應(yīng)性栽培后作為鐵皮石斛良種選育的親本來源，雜交親本在空間上具有遠(yuǎn)緣雜種優(yōu)勢，為不同種質(zhì)間雜交繁育新品種奠定了基礎(chǔ)，同時還可以緩解野生鐵皮石斛種質(zhì)資源短缺的壓力，對保持鐵皮石斛遺傳多樣性具有重要作用。授粉方式、授粉時間等雜交措施以及果實發(fā)育過程的觀測等研究是促進(jìn)資源合理化利用的手段，也是種質(zhì)資源繁育體系中不可或缺的組成部分。

3.1 不同授粉方式下鐵皮石斛結(jié)實率不同

本研究表明，5個鐵皮石斛種質(zhì)均存在自交不親和性。不同種質(zhì)的結(jié)實率不同，雖然種質(zhì)內(nèi)和種質(zhì)間授粉都能夠結(jié)果，但種質(zhì)間授粉結(jié)實率均高于種質(zhì)內(nèi)異株授粉，該結(jié)果與王聰?shù)萚25]的結(jié)果一致。但本試驗中種質(zhì)內(nèi)異株授粉的結(jié)實率(62.50%～77.78%)整體偏高，而種質(zhì)間授粉的結(jié)實率未達(dá)到100%，可能是由于種質(zhì)間授粉更易受種質(zhì)特性的影響，而種質(zhì)內(nèi)異株授粉的花粉來源于同一種質(zhì)，只與自身的遺傳特性相關(guān)，屬于種內(nèi)雜交。相比之下，種質(zhì)間授粉可以獲得較多數(shù)量的蒴果且有利于遺傳多樣性的保持，因此可作為鐵皮石斛種質(zhì)資源的利用及新品種培育的主要技術(shù)手段。

3.2 不同授粉時間下鐵皮石斛座果率不同

本研究表明，授粉時間對蒴果的形成有一定的影響。開花后2～3 d授粉，座果率可達(dá)100%。通過對開花后1～6 d的花朵進(jìn)行授粉發(fā)現(xiàn)，開花后2～3 d授粉柱頭粘性較大，該結(jié)果與李景蕻等[3]、王懷青[27]的結(jié)果一致。開花后4～6 d授粉，座果率逐漸下降，可能與花粉活力下降、柱頭粘性變差有關(guān)，還需要進(jìn)一步對不同開花日期的花粉活力進(jìn)行跟蹤測定。

3.3 蒴果的發(fā)育及種子形態(tài)

蒴果發(fā)育過程中(授粉30 d內(nèi))果莢的長度和寬度均先快速增長；授粉30～60 d，果莢進(jìn)入緩慢增長階段，但寬度增長速度明顯快于長度；授粉60 d，蒴果大小基本穩(wěn)定，此蒴果發(fā)育的整體趨勢與朱波等[10]結(jié)果相一致；授粉100 d，蒴果形態(tài)特征無明顯變化。授粉150 d左右種子完全成熟，呈粉末分散狀，有胚率為94.59%，更適合于無菌播種，后續(xù)也可進(jìn)一步研究無菌播種的萌發(fā)率，以確定雜交種子的活力。

利用雜交等技術(shù)培育出高藥用價值、抗病蟲害的優(yōu)良品種是鐵皮石斛的育種目標(biāo)[28]。授粉方式、授粉時間、蒴果發(fā)育情況的研究為獲得適宜福建省種植的優(yōu)良品種奠定了基礎(chǔ)，但有關(guān)鐵皮石斛雜交后代的培育和有效成分的測定，以及對其性狀的持續(xù)觀察和引進(jìn)并篩選出優(yōu)良品種以擴(kuò)大親本選配的范圍等還有待進(jìn)一步研究。