楊 林, 殷永紅*

(1.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 黃石 435000; 2.腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 黃石 435000)

木蘭花堿(圖1A)，又名木蘭堿，別名唐松草堿，是從中藥木蘭或馬兜鈴中分離得到的生物堿類化合物[1].木蘭花堿被證實(shí)具有多種生物學(xué)活性，降血壓、抗焦慮、抗腫瘤、抗炎、抗生育及消除運(yùn)動(dòng)性疲勞等作用[2-4]，具有非常廣闊的開發(fā)前景.

目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜法(HPLC-UV)測(cè)定中藥及復(fù)方中的木蘭花堿含量[5-6]，也有采用HPLC-UV法測(cè)定木蘭花堿血藥濃度并研究大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的報(bào)道[7].本文擬采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立并驗(yàn)證大鼠血漿中木蘭花堿的濃度，并將該法應(yīng)用到木蘭花堿在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究中.方法靈敏、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可以應(yīng)用到木蘭花堿臨床前的其他方面的研究中，并為該藥物的開發(fā)利用打下基礎(chǔ).

圖1 木蘭花堿(A)和小檗堿(內(nèi)標(biāo)，B)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of magnoflorine (A) and berberine (IS, B)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

美國(guó)Finnigan公司TSQ Quantum Discovery MAX 型液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(LC-MS /MS，美國(guó)Finnigan公司)；賽多利斯Sartorius BS110S電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；DC150-1A 96孔氮吹儀(杭州佑寧儀器有限公司)；AS3120A(鋁)型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；Thermo Micro17R微量臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；WH-2 微型漩渦混合器(上海滬西分析儀器廠).

1.2 試藥

木蘭花堿對(duì)照品購自西安匯林生物科技有限公司；鹽酸小檗堿對(duì)照品(內(nèi)標(biāo)，批號(hào)110713-201814)購自中國(guó)食品藥品檢定研究院.色譜純甲醇、乙腈購自美國(guó)TEDIA(天地)試劑公司；水為娃哈哈飲用純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司).

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Kromasil Eternity-5 C18 色譜柱(2.1 mm × 50 mm，5 μm)；流動(dòng)相為水(A)-乙腈(B)梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～0.2 min，B保持20%；0.2～1.0 min，B由20%增加為60%；1.0～2.0 min，B由60%增加為95%；2.0～2.01 min，B由95%變?yōu)?0%；2.01～3.0 min，B保持20%.流速0.6 mL·min-1；柱溫設(shè)置為30 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL.

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化(ESI)電離源；掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)，正離子模式.噴霧電壓3 500 V；加熱毛細(xì)管溫度(TEM)為270 ℃；鞘氣流速30 psi；輔助氣流速15 psi；碰撞氣(CID)壓力為1.5 mTorr；源內(nèi)碰撞解離電壓(Source CID)為10 V；木蘭花堿與小檗堿(內(nèi)標(biāo))的檢測(cè)離子對(duì)分別選擇：m/z342.4→297.3和m/z335.8→320.2(圖2)，碰撞電壓分別為：24 eV、18 eV[8].

圖2 木蘭花堿(A)和小檗堿(內(nèi)標(biāo)，B)的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrogram of Magnoflorine (A) and Berberine (IS, B)

1.4 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取適量的木蘭花堿對(duì)照品，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液使之溶解完全，并定容至刻度，配制成木蘭花堿濃度為10 g·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存.臨用之前，再用甲醇將儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成濃度為2、10、40、100、250、500 μg·L-1的木蘭花堿標(biāo)準(zhǔn)系列溶液.

1.5 內(nèi)標(biāo)物溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液使之完全溶解，并定容至刻度，配制成小檗堿濃度為1 g·L-1的內(nèi)標(biāo)對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，保存于4 ℃冰箱內(nèi).臨用之前，用甲醇將內(nèi)標(biāo)對(duì)照品儲(chǔ)備溶液稀釋成濃度為400 μg·L-1小檗堿(內(nèi)標(biāo))工作溶液.

1.6 血漿樣品的處理

精密量取100 μL待測(cè)大鼠血漿樣品置于1.5 mL離心管中，精密加入10 μL小檗堿(內(nèi)標(biāo))工作溶液(400 μg·L-1)，充分振蕩，待完全混勻后，再向離心管中加入500 μL乙酸乙酯溶液，充分振蕩約3 min，使之完全混勻.于4 ℃下以14 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后，靜置分層，定量吸取上清乙酸乙酯溶液置于氮吹濃縮儀中進(jìn)行濃縮，待乙酸乙酯溶液吹干后，加入100 μL甲醇溶液復(fù)溶，再于4 ℃下以14 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后，取上清液上樣，每個(gè)樣品定量吸取10 μL注入LC-MS/MS系統(tǒng)，進(jìn)行濃度分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 方法建立

在考察血漿樣品前處理時(shí)，分別嘗試了直接沉淀法、液液萃取法以及固相萃取法.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用直接沉淀法處理大鼠血漿樣品后，在分析物出峰位置有明顯的干擾，導(dǎo)致專屬性較差，分析定量不準(zhǔn)確；而固相萃取法需要較長(zhǎng)的處理時(shí)間，并且成本較高.最后選用液液萃取法進(jìn)行樣品的前處理，既能保證良好的專屬性，還能降低實(shí)驗(yàn)的成本，適合于大鼠的血漿樣品處理.

另外，還考察了不同型號(hào)的色譜柱和流動(dòng)相組成及比例，最后選用Kromasil Eternity-5 C18 色譜柱(2.1 mm × 50 mm，5 μm)；流動(dòng)相采用水和乙腈梯度洗脫，得到了理想的峰形和合適的質(zhì)譜響應(yīng).

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性

根據(jù)“1.6血漿樣品的處理”項(xiàng)下的血漿樣品處理方法，分別制備空白大鼠血漿樣品、加入木蘭花堿和小檗堿(內(nèi)標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)溶液的大鼠血漿樣品和大鼠灌胃給藥后1 h獲得的血漿樣品，并采用“1.3 色譜及質(zhì)譜條件”項(xiàng)下的色譜及質(zhì)譜條件獲得相應(yīng)的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白血漿樣品在木蘭花堿和小檗堿(內(nèi)標(biāo))的出峰時(shí)間不存在干擾，證明該方法具有良好的專屬性，見圖3.

A: 木蘭花堿; B: 小檗堿(內(nèi)標(biāo)); I: 空白大鼠血漿樣品; II: 空白大鼠血漿加入木蘭花堿和小檗堿(內(nèi)標(biāo))溶液樣品; III: 大鼠給藥后1 h的血漿樣品圖3 典型色譜圖Fig.3 Typical chromatogram

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別取木蘭花堿標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10 μL，置于90 μL大鼠空白血漿中，充分振蕩1 min，配制成濃度為0.2、1、4、10、25、50 μg·L-1的大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液.其他操作同“1.6 血漿樣品的處理”項(xiàng)下所述.質(zhì)控樣品(QC)采用木蘭花堿濃度為4、50和400 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液制備，同法制得木蘭花堿終濃度分別為0.4、5和40 μg·L-1的QC樣品，測(cè)定條件同上.以木蘭花堿與小檗堿(內(nèi)標(biāo))的響應(yīng)比值為縱坐標(biāo)(Y)，以木蘭花堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，權(quán)重選擇W=1/X2，得到的回歸方程為Y=0.004 5X+0.068(n=5，R2=0.991 2).結(jié)果表明，木蘭花堿在0.2～50 μg·L-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.2 μg·L-1.

2.2.3 精密度與準(zhǔn)確度

采用低、中、高三個(gè)濃度的QC樣品(n=6)考察木蘭花堿在大鼠空白血漿中的精密度和準(zhǔn)確度，連續(xù)測(cè)定3 d，分別考察日內(nèi)和日間精密度(RSD)與準(zhǔn)確度，每日的測(cè)量采用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線定量.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低、中、高3個(gè)濃度的QC樣品的日內(nèi)和日間精密度(RSD)均小于15%，準(zhǔn)確度在85%～115%的范圍內(nèi)，符合臨床前藥代動(dòng)力學(xué)指導(dǎo)原則對(duì)生物樣品濃度測(cè)試的要求(見表1).

2.2.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

采用三個(gè)濃度的QC樣品(n=3)考察木蘭花堿在大鼠空白血漿中的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng).正常處理的QC樣品響應(yīng)為A；大鼠血漿處理后加入QC標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品響應(yīng)為B，無基質(zhì)的QC樣品響應(yīng)為C.A/B為提取回收率，B/C為基質(zhì)效應(yīng).結(jié)果見表2.

表1 大鼠血漿中木蘭花堿的精密度和準(zhǔn)確度(n=6)

表2 大鼠血漿中木蘭花堿的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)(mean±SD，n=3)

2.2.5 穩(wěn)定性

采用低、高兩個(gè)濃度的QC樣品(n=6)考察木蘭花堿在不同條件下在大鼠血漿中的穩(wěn)定性.分別考察上清液樣本在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24 h的穩(wěn)定性；血漿樣品在實(shí)驗(yàn)臺(tái)放置6 h的穩(wěn)定性；凍融三個(gè)循環(huán)的穩(wěn)定性以及-30 ℃冷凍10 d的穩(wěn)定性，結(jié)果表明木蘭花堿在上述貯存及實(shí)驗(yàn)過程中穩(wěn)定(表3).

表3 大鼠血漿中木蘭花堿的穩(wěn)定性( mean±SD，n=5)

LC-MS/MS法較前人報(bào)道的HPLC-UV法[7]有極大的改進(jìn)，分析時(shí)間由超過20 min縮短為3 min，靈敏度由0.5 mg·L-1提高到0.2 μg·L-1，并提高了分析方法的專屬性.且準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性符合臨床前生物樣品測(cè)試的要求.

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)研究

5只SD大鼠給藥前至少禁食12 h，自由飲水.木蘭花堿對(duì)照品采用1%的羧甲基纖維素鈉溶液均勻分散，配制成濃度為1 g·L-1供試品溶液，給藥前充分振蕩混勻，按照5 mg·kg-1的給藥劑量，灌胃給與大鼠.于灌胃前及灌胃后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24和36 h從大鼠眼球靜脈叢取血250 μL，置肝素化離心管中.4 500 r/min離心10 min，取上層血漿置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?采用DAS 2.0軟件對(duì)血藥濃度進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，處理后得到的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表4.平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖4所示.

表4 大鼠灌胃5 mg·kg-1木蘭花堿主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)(mean±SD，n=5)

圖4 大鼠灌胃 5 mg·kg-1木蘭花堿后平均藥-時(shí)曲線(mean±SD，n=5)Fig.4 Plasma concentration-time profiles for magnoflorine after i.g. doses of 5 mg·kg-1(mean±SD, n=5)

3 結(jié)論

本文采用LC-MS/MS法建立了大鼠血漿中木蘭花堿濃度的測(cè)定方法，并應(yīng)用于大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究.該方法準(zhǔn)確、靈敏、快速、穩(wěn)定，適用于含木蘭花堿的生物樣品的檢測(cè)，為將來的木蘭花堿組織分布和排泄實(shí)驗(yàn)提供了良好的借鑒，對(duì)于其作為創(chuàng)新中藥的開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義.