許慧芳

[摘要]目的 研究地芬諾酯對(duì)大鼠肝臟組織代謝的影響。方法 將32只SD大鼠隨機(jī)分為四組：地芬諾酯給藥組（低、中、高三個(gè)劑量組）和對(duì)照組，每組8只，采集肝組織氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）圖譜，用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）進(jìn)行分析，找出差異代謝產(chǎn)物。結(jié)果 與對(duì)照組比較，地芬諾酯組肝組織中丁酸、丙酸、甘油、亮氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸、谷氨酰胺、木酮糖、赤蘚糖、9H-嘌呤、葡萄糖酸、D-甘露醇、半乳糖、花生四烯酸肝組織代謝物水平均升高，而肌醇水平下降（P<0.05）。結(jié)論 這些代謝物的變化表明給藥后的大鼠氨基酸代謝、脂類代謝和能量代謝都發(fā)生了異常，該研究可為地芬諾酯肝臟代謝提供有用信息。

[關(guān)鍵詞]代謝組學(xué);氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用;地芬諾酯;肝毒性

[中圖分類號(hào)] R927.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）6（a）-0011-03

[Abstract] Objective To study the effect of Diphenoxylate on liver tissue metabolism in rats. Methods Thirty-two SD rats were randomly divided into four groups： Diphenoxylate administration group （low， medium， and high dose groups） and control group， with 8 rats in each group. The gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） of the liver tissue was collected and analyzed by partial least-squares discriminant analysis （PLS-DA） to identify different metabolites. Results Compared with the control group， the levels of these metabonomics in liver tissue such as butyric acid， propionic acid， glycerin， leucine， glycine， L-aspartic acid， glutamine， xylulose， erythrose， 9H-purine， gluconic acid， D-mannitol， galactose， and arachidonic acid increased， while the level of inositol myo-inositol decreased （P<0.05）. Conclusion The changes of these metabolites indicate abnormalities in amino acid metabolism， lipid metabolism， and energy metabolism in rats after administration. This study can provide useful information for liver metabolism of Diphenoxylate.

[Key words] Metabolomics; Gas chromatography-mass spectrometry; Diphenoxylate; Hepatotoxicity

地芬諾酯是哌替啶的衍生物，可作為阿片類藥物的替代品[1]。地芬諾酯片的正常使用不會(huì)使人上癮，因此不在嚴(yán)格控制藥物之列，患者很容易在藥店和醫(yī)院買到。在沒(méi)有麻醉劑的情況下，吸毒者可能會(huì)購(gòu)買大量的地芬諾酯片作為替代品，而大劑量長(zhǎng)期服用地芬諾酯會(huì)導(dǎo)致中毒[2-4]。氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）不僅具有廣譜測(cè)定、分離復(fù)雜混合物的能力，而且具有較高的靈敏度、良好的重復(fù)性和線性響應(yīng)，加上其龐大的化合物庫(kù)，為鑒定工作帶來(lái)了極大的便利[5-6]。近年來(lái)，GC-MS已廣泛應(yīng)用于人類和動(dòng)物的代謝組學(xué)研究，其目的是為了發(fā)現(xiàn)毒理學(xué)和生物標(biāo)志物，進(jìn)行疾病的診斷和分類[7-8]。Wen等[9]為氯胺酮濫用后的大腦組織提供有用的生物標(biāo)志物。本研究基于GC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)，旨在探討大鼠灌胃地芬諾酯后所引起的肝毒性，以期能為臨床用藥給予一定的幫助，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1儀器與條件

Agilent自動(dòng)進(jìn)樣器在不分流模式下加入1.0 μl最終衍生物。色譜分離采用安捷倫6890N氣相色譜儀，色譜柱為HP-5MS（30 m，i.d.，0.25 μm，0.25 mm）。柱溫箱溫度設(shè)定為100℃，恒定5 min，然后以10℃/min的速度上升到300℃，并保持恒定10 min。質(zhì)譜檢測(cè)采用電子轟擊電離（EI）模式，電子能量為70 eV，離子源溫度為250℃，然后在50～550 m/z的質(zhì)量范圍內(nèi)，以1 scan/s的速度采集樣品。

1.2主要藥物與試劑

地芬諾酯購(gòu)于上海宸功生物技術(shù)有限公司;N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA）和三甲基氯硅烷（TMCS）購(gòu)于Sigma;乙腈購(gòu)于天津市康科德科技有限公司。

1.3動(dòng)物處理和樣品采集

32只體重（220±20）g雄性SD大鼠[合格證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009]均來(lái)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，置于自然光照黑暗循環(huán)的（22±2）℃環(huán)境中。所有涉及動(dòng)物及其護(hù)理的操作均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理原則》和《溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理使用指南》執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)前1周適應(yīng)后，將大鼠隨機(jī)分為低劑量組、中劑量組、高劑量組和對(duì)照組，每組8只。將地芬諾酯按12、24、48 mg/ml三種濃度溶解于玉米油中，地芬諾酯組（低、中、高劑量組）每天早晨分別灌胃地芬諾酯12、24、48 mg/kg，連續(xù)7 d。對(duì)照組按同樣方法給予生理鹽水。第8天上午處死大鼠，取肝組織保存于-80℃冰箱。

樣品提取和衍生化方法：稱取100 g冷凍肝組織，加入預(yù)冷250 μl乙腈沉淀蛋白[10]。然后使用SCIENTZ-48組織磨機(jī)研磨2 min，研磨參數(shù)為64 Hz，1800 r/min。再將EP管渦旋混合1 min，冰浴15 min，4℃ 10 000 g離心10 min。取200 μl上清液真空冷凍干燥24 h。凍干粉在70 ℃下加入50 μl甲基羥胺鹽酸鹽（15 mg/ml，吡啶）1 h，然后加入50 μl MSTFA（以1% TMCS為催化劑），加入150 μl正庚烷后終止衍生化。

1.4數(shù)據(jù)處理和模式識(shí)別

對(duì)地芬諾酯組和對(duì)照組的肝組織進(jìn)行GC-MS分析。信噪比>3的峰被采納。這些峰被放入NIST2010質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索。鑒定結(jié)果采取匹配度在70%以上的代謝物。為了補(bǔ)償樣品濃度的差異，對(duì)代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)比較代謝物水平，找出不同的化合物。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將標(biāo)準(zhǔn)化值導(dǎo)入SIMCA-P+11.0軟件（Umetrics，Umea，瑞典），采用PLS-DA多因素分析方法對(duì)地芬諾酯組與對(duì)照組進(jìn)行分析。PLS-DA模型由三個(gè)參數(shù)（R2X，R2Y，Q2Y）來(lái)界定。計(jì)算參數(shù)R2和Q2，檢驗(yàn)擬合優(yōu)度和模型有效性。R2和Q2越接近1，表明該模型的有效性越高。

2結(jié)果

2.1各組大鼠肝組織的質(zhì)譜分析

對(duì)32只大鼠肝組織樣品進(jìn)行了基于質(zhì)譜的代謝物譜分析，包括地芬諾酯組（低、中、高劑量組）和對(duì)照組，共觀察到60個(gè)質(zhì)譜峰。

四組大鼠肝臟樣品的代表GC-MS圖譜如圖1（封三）所示。通過(guò)與NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物的標(biāo)準(zhǔn)離子碎片的質(zhì)荷比和豐度的比較，確定了它們的特征離子碎片譜。參考國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)NIST數(shù)據(jù)庫(kù)所提供的標(biāo)準(zhǔn)光譜圖[11-12]、化合物名稱、結(jié)構(gòu)、分子式、分子量、匹配度和相似性等信息，對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了最終鑒定?；衔镏饕獮榘被帷⒅舅?、糖類、酯類、膽固醇等內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。

2.2各組大鼠肝組織代謝組學(xué)的分析

PLS-DA的得分圖顯示了四組的肝臟樣本散點(diǎn)分布，其中中劑量組大鼠點(diǎn)分布于低劑量組大鼠點(diǎn)中（圖2A，封三）。與PLS-DA相對(duì)應(yīng)的載荷圖揭示了與得分圖對(duì)應(yīng)的貢獻(xiàn)較大的代謝物（圖2B，封三）。置換試驗(yàn)的驗(yàn)證圖表明，地芬諾酯組和對(duì)照組的PLS-DA模型是有據(jù)的和可信的（圖2C，封三）?；诓煌o藥濃度后肝臟GC-MS數(shù)據(jù)的PLS-DA軌跡如圖2D（封三）所示。

2.3大鼠肝組織代謝物相對(duì)水平的變化

為了進(jìn)一步探索代謝產(chǎn)物，PLS-DA模型中第一主成分的重要度在各變量中的投影值（VIP>1），并結(jié)合t檢驗(yàn)找出差異代謝產(chǎn)物。與對(duì)照組比較，地芬諾酯組肝組織中丁酸、丙酸、甘油、亮氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸、谷氨酰胺、木酮糖、赤蘚糖、9H-嘌呤、葡萄糖酸、D-甘露醇、半乳糖、花生四烯酸肝組織代謝物水平均升高，而肌醇水平下降（P<0.05）（表1）。

3討論

大劑量服用地芬諾酯（40～60 mg/次）會(huì)產(chǎn)生欣快感，長(zhǎng)期使用可致依賴性。人最小致死劑量為200 mg/kg。為探討地芬諾酯對(duì)大鼠的肝損傷過(guò)程，本研究比較了地芬諾酯組（低、中、高劑量組）和對(duì)照組的肝臟組織代謝組學(xué)差異。本研究中，丁酸、丙酸、9H-嘌呤、亮氨酸、甘氨酸和天冬氨酸是氨基酸代謝的產(chǎn)物，木酮糖、葡萄糖酸、D-甘露醇、半乳糖、甘油是能量代謝的中間產(chǎn)物。三羧酸循環(huán)（TCA）是三大營(yíng)養(yǎng)素（碳水化合物、脂類、氨基酸）的最終代謝途徑，這些化合物的變化表明TCA的紊亂和機(jī)體代謝的異常[13-16]。TCA的中間產(chǎn)物是一些生物合成的前體，它們提供了能量代謝的主要來(lái)源，提供氨基酸合成的前體。在肝損傷演化過(guò)程中由于能量代謝受到擾動(dòng)以及蛋白質(zhì)降解的增加，改變了大鼠肝組織中自由氨基酸的濃度。因此，氨基酸濃度會(huì)隨著肝臟的不同狀態(tài)而改變。甘氨酸是肝臟線粒體中乙酰輔酶A的共軛氨基酸，其可以減輕肝臟細(xì)胞由于三磷酸腺苷（ATP）消耗引起的損傷。本研究中地芬諾酯組的甘氨酸含量升高，提示肝損傷過(guò)程中能量代謝受到擾動(dòng)從而導(dǎo)致肝功能下降。另外地芬諾酯組大鼠肝組織中的亮氨酸、天冬氨酸升高，這與肝纖維化代謝組學(xué)研究結(jié)果一致[17]。其原因可能是由于肝損傷過(guò)程中擾動(dòng)了蛋白質(zhì)和氨基酸代謝的平衡。

肝臟作為能量代謝的重要器官之一，在機(jī)體碳水化合物和脂類代謝的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。肌醇是半乳糖代謝的中間產(chǎn)物，地芬諾酯組肝組織中肌醇水平下降，提示肝功能損害?；ㄉ南┧崾且环N存在于細(xì)胞膜磷脂中的多不飽和脂肪酸，在大腦、肝臟和肌肉中含量豐富。地芬諾酯組大鼠肝組織中花生四烯酸含量的升高，與機(jī)體自身保護(hù)機(jī)制有關(guān)[18]。

綜上所述，通過(guò)基于GC-MS的代謝組學(xué)方法研究地芬諾酯給藥后的大鼠肝組織代謝物變化，結(jié)果顯示，對(duì)照組和給藥組代謝物完全不同。這些代謝物與氨基酸代謝、脂類代謝和能量代謝有關(guān)。該研究為更好地了解地芬諾酯及其類似物在肝組織中的代謝機(jī)制提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2020-01-21? 本文編輯：任秀蘭）