王 榮, 周 敏, 王蘇霞, 廖 原, 樊 雪, 馬永鈞

(西北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 甘肅省生物電化學(xué)與環(huán)境分析重點實驗室, 甘肅 蘭州 730070)

氨甲環(huán)酸(反式-4-氨甲基環(huán)己烷甲酸,tranexamic acid, TA),又名凝血酸、傳明酸,是一種具有止血作用的化學(xué)合成藥物,已被廣泛應(yīng)用于內(nèi)科、外科及口腔科等臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1-3],作為一種治療牙齦出血癥的有效藥物成分也常被添加在牙膏配方中[4]。此外,人們還發(fā)現(xiàn),氨甲環(huán)酸具有抑制黑色素斑形成、去除皮膚皺紋等美容效果[5,6],它也作為一種皮膚護(hù)理劑廣泛添加在化妝品中。然而,長期使用含有此類藥物的日化品很可能升高人體內(nèi)形成血栓的風(fēng)險并導(dǎo)致其他一些不良作用[7]。日化品中氨甲環(huán)酸的準(zhǔn)確分析方法能對其過量添加行為進(jìn)行更加嚴(yán)格的監(jiān)管,也為保障此類日化品的長期安全使用提供數(shù)據(jù)信息[4,8-10]。

目前,可用于檢測氨甲環(huán)酸含量的主要方法有高效液相色譜法[4,8,9,11-13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10,14-17]、紫外檢測毛細(xì)管電泳法[18]、微芯片分離-化學(xué)發(fā)光聯(lián)用法[19]、熒光法[20-22]和分光光度法[22-24]等。其中針對生物、化妝品之類具有復(fù)雜基底成分的試樣,通常都會采用液相色譜法來進(jìn)行常規(guī)分析[8,9,11,25]。由于氨甲環(huán)酸分子在紫外-可見光區(qū)的光吸收性能較弱且沒有分子熒光特性,為提高液相色譜光檢測器的檢測靈敏度,氨甲環(huán)酸需先進(jìn)行化學(xué)衍生反應(yīng)后再進(jìn)樣分析[13];而為消除過量衍生試劑和衍生副反應(yīng)產(chǎn)物的基底干擾引入的分散液/液微萃取操作環(huán)節(jié),也必然導(dǎo)致樣品分析的前處理過程變得比較繁瑣、復(fù)雜[11]。毛細(xì)管電泳-電致化學(xué)發(fā)光(CE-ECL)聯(lián)用法是一種高分離效率、高選擇性、高靈敏度、低成本的分析新技術(shù),業(yè)已用于臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境、食品等不同領(lǐng)域的實際樣品檢測[26]?；谖覀兇饲皥蟮赖姆椒╗27],本文采用甲醛為N-甲基化衍生試劑,可將氨甲環(huán)酸轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)發(fā)光信號的衍生產(chǎn)物,用CE-ECL法實現(xiàn)了對復(fù)雜基底樣品中氨甲環(huán)酸的分離、檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI-A型多參數(shù)分析測試系統(tǒng)(西安瑞邁電子科技有限公司); CHI760B型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司); F-320型熒光分光光度計(天津港東科技股份有限公司);熔融石英毛細(xì)管(50 cm×75 μm,河北永年光導(dǎo)纖維廠); pH-10型酸度計(德國賽多利斯有限公司)。化學(xué)發(fā)光信號檢測采用三電極系統(tǒng):工作電極采用含稀土類普魯士藍(lán)(Er-PBAs)修飾的鉑盤電極(Φ=0.3 mm),修飾所用的試劑中僅將稀土離子Eu3+更換為Er3+后即可按原文獻(xiàn)方法進(jìn)行制備[44];輔助電極為鉑絲;參比電極為Ag/AgCl (1.0 mol/L KCl鹽橋)電極。

TA(含量>98.0%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);肌氨酸(Sar,含量>99.0%),六水合二氯聯(lián)吡啶釕(含量>98.0%)和殼聚糖(脫乙酰度>95%)(百靈威科技有限公司);納米羥基磷灰石(含量>99.9%,平均粒度約20 nm)(北京德科島金科技有限公司); 1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體(ImidBF4IL,純度>99%)(蘭州中科凱特科工貿(mào)有限公司); D-(+)海藻糖二水合物(純度>99%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);其余試劑均為分析純,實驗用水均為超純水(>18 MΩ·cm)。

1.2 實驗條件

1.2.1電泳測定條件

MTS-gel的合成方法:在一只10 mL的比色管中加入10.0 mmol/L的硝酸鎂1.00 mL、20.0 mmol/L的海藻糖溶液0.50 mL、20.0 mmol/L的硅酸鈉溶液3.00 mL后用水定容,并置于32 ℃的水浴鍋中保溫反應(yīng)13 min,取出后自然冷卻至室溫備用。此凝膠須用前臨時制備,當(dāng)它作為分離添加劑配制運(yùn)行液時,MTS-gel凝膠就能轉(zhuǎn)化為比較穩(wěn)定的溶膠形式,因此配制好的運(yùn)行緩沖液保存于冰箱中就可保證正常使用數(shù)天。

石英毛細(xì)管采用了殼聚糖/磷灰石納米粒子做修飾內(nèi)壁,具體修飾步驟參見文獻(xiàn)[27],所有制備環(huán)節(jié)中僅將含10.0 mg/mL的殼聚糖稀冰醋酸溶液(1.0%, v/v)置換為含10.0 mg/mL殼聚糖+1.0 mg/mL納米羥基磷灰石的稀冰醋酸溶液(1.0%, v/v),而保持其他制備條件完全一致,即可制備出符合分析要求的內(nèi)壁涂飾毛細(xì)管。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液的配制與衍生反應(yīng)步驟

用標(biāo)準(zhǔn)品試劑分別配制1.00 mmol/L氨甲環(huán)酸溶液和1.00 mmol/L肌氨酸溶液儲備液,置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用前按所需濃度?zhǔn)確吸取、用水稀釋后配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液。

稱取1.000 g牙膏膏體樣品于50 mL小燒杯中,先加入0.5 mL 10 mol/L的硝酸鈣,攪拌并靜置5 min后再加入0.5 mL 10 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.0),再攪拌后加入2.0 mL無水乙醇,攪拌均勻后全部轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中,以水定容,放置達(dá)到自然沉降分層,定量吸取上層清液備用。

面膜營養(yǎng)液樣品可采用機(jī)械擠壓法,直接提取適量體積的試樣原液至100 mL小燒杯中,可不加硝酸鈣和磷酸鹽緩沖液,僅加2.0 mL無水乙醇和適量水?dāng)嚢?再全部轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中以水定容,備用。所有預(yù)處理后的待測溶液應(yīng)先加適量內(nèi)標(biāo)物,并按適當(dāng)倍數(shù)稀釋定容,之后可用于下一步的衍生反應(yīng)。

在一只10 mL比色管中先加入1.00 mL 0.25 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=5.95),用移液管準(zhǔn)確加入一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(含內(nèi)標(biāo)物)或待測樣溶液(此刻加入溶液的總體積小于3.0 mL),再加入1.00 mL 0.5 mol/L的甲醛溶液,并用水稀釋到5.0 mL刻度處,于室溫下放置60 min;然后,在比色管中依次加入0.40 mL 0.20 mol/L的氫氧化鈉和0.60 mL 0.01 mol/L的順丁烯二酸溶液,搖勻后放入57 ℃恒溫水浴中加熱反應(yīng)50 min,取出冷卻至室溫;再逐次加入0.25 mL 0.1 mol/L醋酸銨、1.0 mL 0.25 mol/L硼氫化鈉(使用時現(xiàn)配)以及0.50 mL 0.2 mol/L的硼酸溶液,3種試劑的加入間隔時間分別為10、20和10 min。最后,以水定容至10.0 mL刻度處,取此溶液經(jīng)由濾膜過濾后進(jìn)樣測定,也可于冰箱中保存,2周內(nèi)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨甲環(huán)酸與肌氨酸衍生產(chǎn)物的電致化學(xué)發(fā)光響應(yīng)特性

未衍生的氨甲環(huán)酸與肌氨酸均為氨基酸類化合物,它們與聯(lián)吡啶釕試劑產(chǎn)生的電致化學(xué)共發(fā)光信號非常弱,也就無法用柱端ECL方式直接檢測出經(jīng)毛細(xì)管電泳分離后這兩種化合物的電泳峰。但依據(jù)我們此前的研究結(jié)論[27],將一些氨基酸分子的伯胺基或仲氨基通過N-甲基化衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化為叔氨基時,其電致化學(xué)發(fā)光效能會有極大地提高,因此我們采用CE-ECL法對氨甲環(huán)酸和肌氨酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了衍生反應(yīng)前后的對比試驗。如圖1所示,a曲線為未經(jīng)衍生的100 μmol/L氨甲環(huán)酸和25.0 μmol/L肌氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳圖,通過加標(biāo)試驗證實只有242 s處的極弱電泳峰歸屬于未衍生的肌氨酸,其他位置的弱峰均為試劑中帶入的雜質(zhì)峰,同時說明進(jìn)樣100 μmol/L的氨甲環(huán)酸不會出現(xiàn)電泳峰。但如b曲線所示,進(jìn)樣氨甲環(huán)酸和肌氨酸的混合衍生產(chǎn)物后卻能發(fā)現(xiàn)3個強(qiáng)電泳峰,經(jīng)過加標(biāo)試驗可以確定:1號峰源于反應(yīng)試劑甲醛的一種發(fā)光衍生產(chǎn)物,2、3號電泳峰則分別歸屬于氨甲環(huán)酸和肌氨酸各自的衍生產(chǎn)物。對比曲線a和b可以發(fā)現(xiàn),衍生前后氨甲環(huán)酸分子由不出峰到形成了高達(dá)3 600(a.u.)的強(qiáng)發(fā)光信號峰,而在相同濃度水平上的肌氨酸分子衍生前后的發(fā)光峰也至少增敏了20余倍,并且均未產(chǎn)生屬于其他衍生副產(chǎn)物的電泳峰。這表明用甲醛為N-甲基化衍生試劑時,經(jīng)柱前衍生反應(yīng),氨甲環(huán)酸和肌氨酸各自都可以得到具有強(qiáng)ECL發(fā)光響應(yīng)信號的單一衍生產(chǎn)物,而且它們發(fā)光峰的強(qiáng)度都與其衍生前的初始濃度有定量關(guān)系,因此肌氨酸適合被選定為測定氨甲環(huán)酸的內(nèi)標(biāo)物,而采用內(nèi)標(biāo)法對實際樣品中的氨甲環(huán)酸進(jìn)行定量測定,保證了本方法的準(zhǔn)確度不再受柱前衍生反應(yīng)條件波動帶來的誤差影響。

圖 1 氨甲環(huán)酸與肌氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)衍生反應(yīng)(a)前、 (b)后的對比電泳圖Fig. 1 Contrastive electropherograms of the mixed standard solution of tranexamic acid (TA) and sarcosine (Sar) (a) before and (b) after the derivatization reaction 1. unknown derivative form formaldehyde reagent; 2. TA derivative; 3. Sar derivative. TA: 100 μmol/L; Sar: 25.0 μmol/L.

2.2 背景電解質(zhì)中分離添加劑的優(yōu)化

圖 3 具有不同硅酸根與鎂離子組成比MTS-gel凝膠的 共振瑞利光散射光譜圖Fig. 3 RRS spectra of MTS-gel with the different substance constituent ratio (R) of to Mg2+ A set of curves (a-f) shows influence of the MTS-gel concentrations on their RRS peak intensities when fixing a constant R value (R=6). Inset shows the variation of the slope (k) of linear fitting equations existed between RRS peak intensities of MTS-gel and its concentrations when modifying the R value (R=0-10). MTS-gel: a. 200 μmol/L; b. 250 μmol/L: c. 300 μmol/L; d. 350 μmol/L: e. 400 μmol/L; f. 450 μmol/L.

圖 2 MTS-gel的加入量對氨甲環(huán)酸和肌氨酸發(fā)光衍生物 電泳分離度的影響Fig. 2 Effect of the added amount of Mg2+-trehalose- (MTS-gel) on the electrophoresis resolution between TA and Sar derivatives Δt: difference of the migration time of Sar and TA.

2.3 用共振光散射光譜法確定MTS-gel的化學(xué)組成

圖 4 用內(nèi)標(biāo)法測定一系列不同濃度氨甲環(huán)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的CE-ECL電泳圖Fig. 4 Serial electrophoregrams of the standard solution samples with different TA concentrations for determination by internal standard method Sar: 25.0 μmol/L. TA: a. 25.0 μmol/L; b. 50.0 μmol/L; c. 100 μmol/L; d. 250 μmol/L; e. 500 μmol/L.

2.4 測定氨甲環(huán)酸的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

在優(yōu)化的分析條件下,首先做了內(nèi)標(biāo)物肌氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線,發(fā)現(xiàn)肌氨酸初始濃度(CSar, μmol/L)在25～400 μmol/L范圍內(nèi)與其衍生物電泳峰的強(qiáng)度(ISar)呈線性關(guān)系,回歸方程為ISar=21.39+26.22CSar(相關(guān)系數(shù)r2=0.999 0)。肌氨酸的檢出限為4.8 μmol/L(S/N=3)。再固定肌氨酸為25.0 μmol/L,僅改變氨甲環(huán)酸濃度,對這一系列混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行柱前衍生并紀(jì)錄其CE-ECL電泳圖。由圖4可見,分別屬于氨甲環(huán)酸和肌氨酸內(nèi)標(biāo)物的電泳峰的峰形均非常對稱、半峰寬狹窄、分離度良好,因此可以通過直接測取兩個電泳峰的峰高比為定量依據(jù)。實驗測得氨甲環(huán)酸的初始濃度(CTA, μmol/L)與電泳圖中兩個衍生產(chǎn)物的發(fā)光峰高比值ITA/ISar之間在10～750 μmol/L的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,回歸方程為ITA/ISar=-0.510 3+0.022 6CTA(r2=0.999 3)。經(jīng)計算得出檢出限為3.6 μmol/L(S/N=3)。對比這些定量參數(shù)可知,本法略優(yōu)于文獻(xiàn)[18]報道的CE-UV測氨甲環(huán)酸方法。以含100 μmol/L氨甲環(huán)酸+25.0 μmol/L肌氨酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為試樣,經(jīng)衍生后反復(fù)平行進(jìn)樣測定8次,經(jīng)統(tǒng)計得到氨甲環(huán)酸和肌氨酸峰高度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于3.6%和2.3%,而相應(yīng)電泳峰遷移時間的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差值分別為3.6%和2.9%,表明本法測定結(jié)果的精密度良好。

2.5 實際樣品測定

在優(yōu)化的分析條件下,采用內(nèi)標(biāo)法對市購的3種牙膏和2種面膜中的氨甲環(huán)酸含量進(jìn)行了測定,結(jié)果如表1所示。在實際樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,回收率值介于92.5%～104.0%,表明本法的準(zhǔn)確度較好。目前,國家市場監(jiān)管部門還未對牙膏中氨甲環(huán)酸的添加量作強(qiáng)制性限定;中國臺灣化妝品衛(wèi)生管理條例中初步規(guī)定,化妝品中氨甲環(huán)酸的最高添加量限為2%～3%;中國香港地區(qū)則明確規(guī)定,氨甲環(huán)酸在牙膏中的限量為0.05%[4]。由表1數(shù)據(jù)可知,國內(nèi)市場中這幾種日化品中氨甲環(huán)酸的含量略有差異,但基本上均能符合安全要求。

表 1 實際樣品中氨甲環(huán)酸含量的測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論