朱 睿，劉艷霖

（深圳信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院 交通與環(huán)境學(xué)院，廣東深圳 518000)

酶不僅在水溶液里而且在有機(jī)溶劑中也具有催化活性，這已經(jīng)成為一個公認(rèn)的事實(shí)。在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行酶催化已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域的一個主要研究方向，受到國內(nèi)外學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的廣泛關(guān)注和重視。在有機(jī)溶劑中，酶能催化在水里不能進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，其穩(wěn)定性顯著提高，與在水里相比，酶的活性和各種專一性不僅會發(fā)生變化，而且還能通過改變反應(yīng)介質(zhì)（而不是通過改造酶本身）來進(jìn)行調(diào)節(jié)和控制。同時，由于疏水性反應(yīng)物溶解度的增加，產(chǎn)物和酶的分離提純便利，由水引起的副反應(yīng)受到抑制，以及微生物對反應(yīng)器的污染減少，使酶作為催化劑在工業(yè)應(yīng)用上的價值大大提高。要充分利用這些優(yōu)越性，就必須對非水酶學(xué)的基本理論進(jìn)行深入研究，如酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、酶的催化機(jī)理、溶劑和水與酶的相互作用及其對酶催化的動力學(xué)和熱力學(xué)方面的影響，以及酶結(jié)構(gòu)與功能之間的相互關(guān)系。近年來，非水酶學(xué)的基本理論研究已經(jīng)取得了重大突破。

在有機(jī)溶劑中可直接使用酶粉作催化劑，但是效果并不太好。一方面天然酶在有機(jī)溶劑中容易變形而失活；另一方面酶粉在有機(jī)溶劑中分散性差，容易聚結(jié)成團(tuán)。從工程應(yīng)用的角度看，過去在水溶液中發(fā)展和使用的酶固定化方法是有機(jī)介質(zhì)中保護(hù)酶免遭變形、變性的最有前途的方法。尼龍布價格低廉、固定化操作簡便、酶活力回收高，并在非水介質(zhì)中能對酶形成良好的保護(hù)作用，是固定酶的優(yōu)良載體。利用共價鍵結(jié)合法制備的尼龍固定化木瓜蛋白酶，在有機(jī)溶劑中具有良好的穩(wěn)定性和較高使用效率，適合用于非水酶的實(shí)驗(yàn)開展動力學(xué)性能研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

木瓜蛋白酶（papain，PA）結(jié)晶純酶和酪蛋白為Sigma公司產(chǎn)品；尼龍布（100目）；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 試劑

（1）木瓜蛋白酶精酶。

（2）尼龍布（3cm×3cm）

（3）甲醇溶液（含18.6%CaC12和18.6%水）。

（4）3.5mo1/L HCl。

（5）5%戊二醛（以25%戊二醛和0.1mol/L pH為7.2的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液配制）。

（6）0.1mol/L pH為7.2 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。

（7）0.5mo1/L NaCl（用0.1mol/L pH為7.2磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液配制）。

（8）激活劑（0.1mol/L pH為7.2磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，內(nèi)含36mmol/L半胱氨酸和0.6mmol/L EDTA）。

（9）1%酪蛋白溶液（用0.1mol/L pH為7.2磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液配制）。

（10）200g/L三氯乙酸（TCA）溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

SHA-B型恒溫振蕩器，JJ-1精密電動攪拌器，HWS24型電熱恒溫水浴鍋，752紫外光柵分光光度計(jì)，PHSJ-4A精密pH計(jì)，AB204-N萬分之一精密電子天平。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 固定方法

（1）每組取5塊尼龍布（3cm×3cm）洗凈，晾干。用含18.6%CaC12和18.6%水的甲醇溶液在50℃下保溫10s左右，并輕輕攪拌至尼龍布發(fā)黏，取出用水沖去污物，用吸水紙吸干。

（2）尼龍布用3.5mo1/L HCl在室溫水解45min，用蒸餾水洗至pH中性。

（3）尼龍布用5%戊二醛在室溫下浸泡偶聯(lián)20min。

（4）取出尼龍布，用0.1mol/L pH為7.2磷酸緩沖液反復(fù)洗去多余的戊二醛，吸干，立即用酶液在4℃下固定3.5h（酶液用量是每塊布為1mL）。

（5）從酶液中取出尼龍布，用0.5mo1/L NaCl（用0.1mol/L pH為7.2磷酸緩沖液配制）洗去多余的酶蛋白，即得尼龍布固定化木瓜蛋白酶。

1.4.2 酶活力測定方法

取上述尼龍布固定化酶一塊，加入0.25mL激活劑（0.1mol/L pH 7.2磷酸緩沖液內(nèi)含36mmol/L半胱氨酸，0.6mmol/L EDTA）和2.5mL 預(yù)設(shè)濃度的有機(jī)溶劑（用0.1mol/L pH 7.2磷酸緩沖液稀釋），于37℃下預(yù)熱10min，加入預(yù)設(shè)濃度的酪蛋白溶液0.5mL（用1%酪蛋白與0.1mol/L pH 7.2磷酸緩沖液配制），37℃下恒溫水浴振蕩反應(yīng)10min（可溶性有機(jī)溶劑如：二甲基亞砜、1，4-二氧六環(huán)、甲醇、乙腈、乙醇、丙醇、四氫呋喃，恒溫水浴振蕩反應(yīng)，160次/min；不溶性有機(jī)溶劑如：乙酸乙酯、丁醇、戊醇、己醇、苯、甲苯、環(huán)己烷、十二醇，水浴高速攪拌反應(yīng)，250r/min），然后加入1.0mL 200g/L三氯乙酸溶液終止酶反應(yīng)。對照管先加入200g/L三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他與測定管相同。過濾，取其上清液于波長275nm處測定消光值。在上述條件下，反應(yīng)體系每增加1個吸光值為一個酶活力單位（U）；所以木瓜蛋白酶反應(yīng)速度（v）為：U/（mL·min）。其操作過程，如表1所示：

表1 酶活測定操作步驟

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖液中的IPN動力學(xué)曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖1所示，在沒有有機(jī)溶劑存在的條件下，IPN的米氏常數(shù)Km為1.335g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）為0.022U/（mL·min）。

圖1 緩沖液中的IPN動力曲線

2.2 不同濃度乙醇IPN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖2所示，在10%和20%的乙醇溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為4.520g/L和15.851g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.059U/mL·min和0.197U/（mL·min）。在10%和20%的乙醇溶液中，Km分別為0%乙醇的3.38倍和11.87倍，Km上升，表明乙醇濃度升高時，酶對底物的親和力下降。此時vmax分別為0%乙醇中的2.68倍與8.95倍，處于上升的趨勢。

圖2 不同濃度的乙醇IPN動力曲線

2.3 不同濃度甲醇IPN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖3所示，在10%和20%的甲醇溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為2.32g/L和3.98g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.019U/（mL·min）和0.036U/（mL·min）。在10%和20%的甲醇溶液中，Km分別為0%甲醇的1.72倍和2.98倍，Km上升，表明甲醇濃度升高時，酶對底物的親和力下降。此時vmax分別為0%甲醇中的0.86倍與1.63倍，處于上升的趨勢。

圖3 不同濃度的甲醇IPN動力曲線

2.4 不同濃度1，4-二氧六環(huán)IPN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖4所示，在10%和20%的1，4-二氧六環(huán)溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為3.63g/L和3.99g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.035U/（mL·min）和0.044U/（mL·min）。在10%和20%的1，4-二氧六環(huán)溶液中，Km分別為0%1，4-二氧六環(huán)的2.71倍和2.99倍，Km上升，表明1，4-二氧六環(huán)濃度升高時，酶對底物的親和力下降。此時vmax分別為0%1，4-二氧六環(huán)中的1.59倍與2倍，處于上升的趨勢。

圖4 不同濃度的1，4-二氧六環(huán)IPN動力曲線

2.5 不同濃度四氫呋喃I(xiàn)PN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖5所示，在10%和20%的四氫呋喃溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為3.17g/L和8.64g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.030U/（mL·min）和0.052U/（mL·min）。在10%和20%的四氫呋喃溶液中，Km分別為0%四氫呋喃的2.37倍和6.47倍，Km上升，表明四氫呋喃濃度升高時，酶對底物的親和力下降。此時vmax分別為0%四氫呋喃中的1.36倍與2.36倍，處于上升的趨勢。

圖5 不同濃度四氫呋喃I(xiàn)PN動力曲線

2.6 不同濃度二甲基亞砜IPN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖6所示，在10%和20%的二甲基亞砜溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為3.89g/L和4.02g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.056U/（mL·min）和0.057U/（mL·min）。在10%和20%的二甲基亞砜溶液中，Km分別為0%二甲基亞砜的2.91倍和3.01倍，Km上升，表明二甲基亞砜濃度升高時，酶對底物的親和力下降。此時vmax分別為0%二甲基亞砜中的2.55倍與2.56倍，處于上升的趨勢。

圖6 不同濃度二甲基亞砜IPN動力曲線

2.7 不同濃度正丙醇IPN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖7所示，在10%和20%的正丙醇溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為11.76g/L和2.00g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.166U/（mL·min）和0.022U/（mL·min）。在10%和20%的正丙醇溶液中，Km分別為0%正丙醇的8.80倍和1.49倍，Km值下降，表明正丙醇濃度升高時，酶對底物的親和力上升。此時vmax分別為0%正丙醇中的7.55倍與1倍，處于下降的趨勢。

圖7 不同濃度正丙醇IPN動力曲線

2.8 不同濃度乙腈IPN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖8所示，在10%和20%的乙腈溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為13.51g/L和1.40g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.108U/（mL·min）和0.022U/（mL·min）。在10%和20%的乙腈溶液中，Km分別為0%乙腈的10.12倍和1.04倍，Km下降，表明乙腈濃度升高時，酶對底物的親和力上升。此時vmax分別為0%乙腈中的4.90倍與1倍，處于下降的趨勢。

圖8 不同濃度乙腈IPN動力曲線

2.9 不同濃度乙酸乙酯IPN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖9所示，在10%和20%的乙酸乙酯溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為2.18g/L和0.76g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.021U/（mL·min）和0.014U（mL·min）。在10%和20%的乙酸乙酯溶液中，Km值分別為0%乙酸乙酯的1.63倍和56.92%，Km下降，表明乙酸乙酯濃度升高時，酶對底物的親和力上升。此時vmax分別為0%乙酸乙酯中的95.45%與63.63%，處于下降的趨勢。

2.1 0 不同濃度丁醇IPN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖10所示，在10%和20%的丁醇溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為1.22g/L和0.51g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.018U/（mL·min）和0.009U/（mL·min）。在10%和20%的丁醇溶液中，Km分別為0%丁醇的91.38%和38.20%，Km下降，表明丁醇濃度升高時，酶對底物的親和力上升。此時vmax分別為0%丁醇中的81.81%與40.9%，處于下降的趨勢。

圖9 不同濃度乙酸乙酯IPN動力曲線

圖10 不同濃度丁醇IPN動力曲線

2.1 1 不同濃度戊醇IPN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖11所示，在10%和20%的戊醇溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為1.609g/L和1.03g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.020U/（mL·min）和0.009U/（mL·min）。在10%和20%的戊醇溶液中，Km分別為0%戊醇的1.21倍和77.15%，Km下降，表明戊醇濃度升高時，酶對底物的親和力上升。此時vmax分別為0%戊醇中的90.90%與40.9%，處于下降的趨勢。

圖11 不同濃度戊醇IPN動力曲線

2.1 2 不同濃度己醇IPN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖12所示，在10%和20%的己醇溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為2.46g/L和0.54g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.024U/（mL·min）和0.01U/（mL·min）。在10%和20%的己醇溶液中，Km分別為0%乙醇的1.84倍和40.45%，Km下降，表明己醇濃度升高時，酶對底物的親和力上升。此時vmax分別為0%己醇中的1.09倍與45.45%，處于下降的趨勢。

圖12 不同濃度己醇IPN動力曲線

2.1 3 不同濃度環(huán)己環(huán)IPN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖13所示，在10%和20%的環(huán)己環(huán)溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為4.35g/L和12.19g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.020U/（mL·min）和0.058U/（mL·min）。在10%和20%的環(huán)己環(huán)溶液中，Km分別為0%環(huán)己環(huán)的3.25倍和9.13倍，Km上升，表明環(huán)己環(huán)濃度升高時，酶對底物的親和力下降。此時vmax分別為0%環(huán)己環(huán)中的90.90%與2.63倍，處于上升的趨勢。

圖13 不同濃度環(huán)己環(huán)IPN動力曲線

2.1 4 不同濃度苯IPN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖14所示，在10%和20%的苯溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為5.75g/L和1.93g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.048U/（mL·min）和0.017U/（mL·min）。在10%和20%的苯溶液中，Km分別為0%苯的4.31倍和1.44倍，Km下降，表明己醇濃度升高時，酶對底物的親和力上升。此時vmax分別為0%苯中的2.18倍與77.27%，處于下降的趨勢。

圖14 不同濃度苯IPN動力曲線圖

2.1 5 不同濃度正十二醇IPN動力曲線

采用Lineweaver-Burk作圖法，如圖15所示，在10%和20%的正十二醇溶液中，IPN的米氏常數(shù)Km分別為3.39g/L和1.42g/L，最大反應(yīng)速度（vmax）分別為0.042U/（mL·min）和0.024U（mL·min）。在10%和20%的正十二醇溶液中，Km分別為0%正十二醇的2.53倍和1.06倍，Km下降，表明正十二醇濃度升高時，酶對底物的親和力上升。此時vmax分別為0%正十二醇中的1.90倍與1.09倍，處于下降的趨勢。

3 結(jié)語

實(shí)驗(yàn)中大部分的有機(jī)溶劑對酶與底物的結(jié)合能力都有很大的削弱作用，其中20%乙酸乙酯、10%和20%的丁醇、20%的戊醇對酶與底物的結(jié)合有促進(jìn)作用，都比在無有機(jī)溶劑存在的情況下高。

從以上十四種溶劑綜合考慮，可以把這十四種溶劑分為兩大組別。其中己醇、甲醇、1，4-二氧六環(huán)、四氫呋喃、二甲基亞砜、環(huán)己烷的Km與vmax隨著有機(jī)溶劑濃度的上升（10%-20%）而上升，表明在這些溶劑中，濃度從10%上升到20%，酶與底物的結(jié)合力下降，而最大反應(yīng)速度卻上升；正丙醇、乙腈、乙酸乙酯、丁醇、戊醇、己醇、苯、正十二醇的Km與vmax隨著有機(jī)溶劑濃度的上升（10%～20%）而下降，表明在這些溶劑中，濃度從10%上升到20%，酶與底物的結(jié)合力上升，而最大反應(yīng)速度卻下降。