王雪芹 , 邢榮娥 , 于華華 , 李鵬程
(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海洋大科學(xué)中心, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237)
魚糜食品因其美味可口, 營養(yǎng)價(jià)值高, 食用方便,日漸成為消費(fèi)者餐桌上的新寵。但隨著食品加工技術(shù)的發(fā)展, 消費(fèi)者對(duì)于魚糜食品的口感及外觀要求也越來越高。魚糜食品的保水性, 是衡量該品質(zhì)的重要指標(biāo), 并對(duì)魚糜的質(zhì)地、彈性、嫩度、風(fēng)味、多汁性、口感和出品率產(chǎn)生重要影響[1]。加工后所得的成品保持原來的水分越多, 不僅可以保證肉品的口感鮮嫩而且富有彈性, 還可以減少營養(yǎng)汁液成分和風(fēng)味物質(zhì)的流失。然而, 實(shí)際生產(chǎn)中, 魚糜制品出水一直是個(gè)行業(yè)難題, 如真空包裝產(chǎn)品出水; 產(chǎn)品內(nèi)部形成孔洞和積水; 收縮膜包裝的魚腸食品在膜面下形成積水等[2]。對(duì)于肉類加工企業(yè), 較低的保水性意味著較大的經(jīng)濟(jì)損失, 包括水分流失帶來的經(jīng)濟(jì)損失和降低成品率帶來的損失; 對(duì)于消費(fèi)者, 保水性差會(huì)影響到原料肉在貯藏銷售過程中的外觀質(zhì)量, 表面水分多, 往往顏色發(fā)白, 給人不新鮮的感覺, 且蛋白質(zhì)易發(fā)生變性, 肉質(zhì)易碎, 口感變粗糙[3]。我國是肉類加工大國,肉類工業(yè)發(fā)展迅速, 按3%的損失計(jì)算, 汁液損失達(dá)23萬噸, 可造成直接經(jīng)濟(jì)損失20多億元[4]。因此, 如何有效的減少魚糜食品的水分流失, 同時(shí)又能保證產(chǎn)品質(zhì)量和降低生產(chǎn)成本, 是魚糜食品加工企業(yè)所關(guān)注的。
有關(guān)改善肉類保水性能方面的研究很多, 采用食品添加劑來提高肉類保水性是最為有效的方法,常用的保水劑有: 食鹽、磷酸鹽、大豆蛋白、食用膠、魔芋粉、玉米淀粉、木薯淀粉等[4]。盡管根據(jù)現(xiàn)有食品添加劑的國家標(biāo)準(zhǔn)(GB2760-2011)規(guī)定, 允許食品生產(chǎn)企業(yè)在規(guī)定使用量范圍內(nèi)可以在肉類、水產(chǎn)等食品中使用保水劑。 然而隨著保水劑的廣泛應(yīng)用,肉類及水產(chǎn)食品時(shí)常會(huì)遭遇保水劑添加量超標(biāo)的問題。據(jù)媒體報(bào)道, 去年深圳市小肥羊?qū)崢I(yè)有限公司生產(chǎn)的超精豬肉丸被檢出“復(fù)合磷酸鹽”項(xiàng)目不合格。此前我國出口的水產(chǎn)品也曾多次遭遇過磷酸鹽超標(biāo)的問題[5], 這不僅危害消費(fèi)者的利益, 還阻止了我國水產(chǎn)品的出口量, 降低了貿(mào)易出口額。目前大部分企業(yè)采用三聚磷酸鹽、焦磷酸鹽、六偏磷酸鹽的混合制劑來提高肉的保水性[6-7]。而磷酸鹽在高濃度下(0.4%~0.5%), 將產(chǎn)生令人不愉快的金屬澀味, 導(dǎo)致肉制品風(fēng)味惡化, 組織結(jié)構(gòu)粗糙[8]。當(dāng)用量超過0.5%時(shí), 將引起機(jī)體鈣磷比失衡, 輕則會(huì)引起人體腹痛、腹瀉, 重則將出現(xiàn)高血鈣癥、低血鈣癥以及佝僂病、骨質(zhì)疏松等代謝性骨病[9]。而在低于某個(gè)限度內(nèi), 在乳化產(chǎn)品中有不愉快的后味。此外, 磷酸鹽在調(diào)節(jié)pH值時(shí)會(huì)使肉的顏色下降和 pH值升高, 進(jìn)而造成脂肪分解, 縮短貨架期[10]。
為了滿足廣大消費(fèi)者日益提高的消費(fèi)水平和要求,肉類加工企業(yè)將研究重點(diǎn)放在尋找安全有效的天然保水劑上。殼聚糖、殼寡糖是一種從蝦、蟹殼提取的天然高分子物質(zhì), 它具有良好的成膜性、保水性和抑菌防腐作用[11]。近幾年來, 不少企業(yè)選用食品表面涂膜液的方式維持肉類的保水性, 該表面涂膜液形成的膜通常要求具有較高的透濕性, 以免水分聚集在膜的內(nèi)側(cè),易于微生物生長繁殖; 但透濕性又不能太高, 否則會(huì)使肉在貯存過程中失水嚴(yán)重[12]。海洋生物多糖/寡糖不僅具有較好的抗菌性和成膜性, 而且其形成的膜具有良好的透氣性, 在肉類工業(yè)特別是冷卻肉的貯存保鮮中已有部分應(yīng)用[13-14]。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖可降低鮮肉中脂肪氧化和酸敗, 可以改善鮮肉貯藏期間的顏色、含水量[15]; 吉偉之[14]等對(duì)殼聚糖復(fù)合涂膜液在冷卻肉保鮮中的應(yīng)用進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)殼聚糖對(duì) 20℃及4℃下貯藏的鮮肉都有明顯的保鮮效果; Soares[16]等人研究發(fā)現(xiàn)0.5%和0.75%殼聚糖可有效抑菌, 防止腐敗,小劑量涂膜就可有效抑制油脂氧化, 且1.5%(w/v)的殼聚糖涂膜后的鮭魚涂膜損失率、干耗和滴水損失率都較小。綜上所述, 海洋生物多糖/寡糖有望成為新一代的保水保鮮劑。
本文主要以海洋生物多糖/寡糖為研究對(duì)象, 通過對(duì)多糖/寡糖的添加方式、種類、添加濃度進(jìn)行篩選, 以解凍失水率為響應(yīng)值, 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析, 確定保水效果最佳的添加條件; 并對(duì)魚糜制品進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)分析, 綜合評(píng)價(jià)海洋生物多糖/寡糖的保水作用。
新鮮魚糜, 即新鮮魚打撈上來以后直接采肉, 攪碎制得, 由海欣食品股份有限公司提供; 殼聚糖 1號(hào),分子量約20萬~30萬Da, 購買于阿拉丁試劑有限公司;殼聚糖2號(hào), 分子量約160萬Da, 由青島云宙生物科技有限公司提供; 殼寡糖, 分子量約1 000 Da~2 000 Da,由山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥科技有限公司提供; 海藻酸鈉和卡拉膠, 由山東潔晶集團(tuán)股份有限公司提供。
1.2.1 浸泡法
分別配制0.5%的寡糖、殼聚糖1號(hào)、殼聚糖2號(hào)、海藻酸鈉和卡拉膠水溶液, 稱取適量魚糜揉制成丸狀,分別浸入溶液中, 浸泡 30 min后取出, 放入-80℃ 冰箱中冷凍4 h, 之后解凍過夜, 測(cè)定解凍失水率。
1.2.2 直接添加法
分別稱取魚糜質(zhì)量比0.5%的寡糖、殼聚糖1號(hào)、殼聚糖2號(hào)、海藻酸鈉和卡拉膠, 添加到魚糜中, 揉均勻后, 制成丸狀, 放入-80℃冰箱中冷凍4 h, 之后解凍過夜, 測(cè)定解凍失水率。
1.2.3 保水性測(cè)定指標(biāo)及方法
測(cè)定指標(biāo)采用解凍失水率來衡量, 解凍失水率(%)=(A-B)/A×100 %.
其中:A為魚丸經(jīng)-80℃冷凍后, 稱得的質(zhì)量, 單位: g,B為魚丸解凍過夜后, 稱得的質(zhì)量, 單位: g。
1.2.4 掃描電鏡觀測(cè)魚丸的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)
將制備好的各組魚丸分別切成長為8 mm, 寬為6 mm, 高為4 mm的小塊, 經(jīng)脫脂、固定、漂洗后, 放入冷凍干燥機(jī), 進(jìn)行 24 h的冷凍干燥, 放于陰涼干燥處, 等待掃描電鏡測(cè)試。
試驗(yàn)重復(fù) 3次, 結(jié)果以平均值±SD表示。采用SPSS 18.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù), 進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。
分別將魚丸浸泡在寡糖、殼聚糖1號(hào)、殼聚糖2號(hào)、海藻酸鈉和卡拉膠溶液中, 經(jīng)冷凍、解凍, 測(cè)得其解凍失水率如圖 1所示: 空白組的解凍失水率最高, 達(dá)到了 13.43%±1.56%; 磷酸鹽組為魚丸浸泡在0.5%磷酸鹽的溶液中 30 min, 其解凍失水率最低,為 5.22%±0.41%。此外, 從圖 1可以看出, 魚丸浸泡在不同的多糖/寡糖溶液中 30 min后, 解凍失水率均有不同程度的降低, 與空白組相比, 分別達(dá)到了顯著性差異(P<0.05)。其中海藻酸鈉和卡拉膠對(duì)魚丸的保水性最好, 其解凍失水率分別為 5.83%±0.51%和6.08%±0.45%, 與空白組相比, 分別減少了 56.63%和54.77%; 其次為寡糖組, 解凍失水率為8.90%±0.91%,殼聚糖1號(hào)和殼聚糖2號(hào)對(duì)魚丸的保水性較差。
圖1 浸泡法對(duì)魚丸保水性的影響Fig. 1 Effects of soaking method on the water-holding capacity of fish meatballs
實(shí)驗(yàn)過程中, 我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)浸泡的魚丸, 在其表面會(huì)形成一層膜, 一定程度上減少了肌肉表面的水分蒸發(fā), 在解凍過程中能夠起到保水持水的作用。這與高曉平等[17]研究得到的結(jié)論一致, 其采用各配方殼聚糖涂抹液處理冷卻肉, 發(fā)現(xiàn)冷卻肉滴水損失率比對(duì)照組減少了46%。但值得注意的是, 采用浸泡法處理的各組魚丸, 經(jīng)冷凍后, 魚丸表面會(huì)形成一層冰膜, 尤其是殼聚糖1號(hào)和殼聚糖2號(hào)的冰膜較厚, 因此與其他多糖組相比較, 解凍失水率較高??紤]到浸泡覆膜會(huì)影響魚丸的口感, 且殼聚糖不易溶于水, 我們進(jìn)一步研究了多糖/寡糖直接添加法對(duì)魚丸保水性的影響。
分別將魚糜質(zhì)量比0.5%的磷酸鹽、寡糖、殼聚糖1號(hào)、殼聚糖 2號(hào)、海藻酸鈉和卡拉膠直接添加到魚糜中, 充分揉均勻, 制成魚丸, 經(jīng)冷凍、解凍后測(cè)得魚丸的解凍失水率如圖 2所示: 空白組解凍失水率最高, 為 15.17%±1.57%, 磷酸鹽組解凍失水率最低, 為4.01%±0.12%; 殼聚糖1號(hào)、殼聚糖2號(hào)和海藻酸鈉組的保水性較好, 魚丸解凍失水率分別為5.20%±0.26%, 5.28%±0.22%, 5.20%±0.45%, 與空白組相比, 魚丸解凍失水率分別減少了65.71%, 65.17%和65.68%, 且與磷酸鹽組無顯著性差異(P<0.05); 寡糖組和卡拉膠組中魚丸解凍失水率較高, 但與空白組相比, 也達(dá)到了顯著性差異(P<0.05)。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)將選擇殼聚糖1號(hào)、殼聚糖2號(hào)和海藻酸鈉作下一步的保水性研究。
圖2 直接添加法對(duì)魚丸保水性的影響Fig. 2 Effects of direct addition on the water-holding capacity of fish meatballs
本實(shí)驗(yàn)對(duì)殼聚糖1、殼聚糖2號(hào)和海藻酸鈉的添加量進(jìn)行篩選, 選擇魚糜質(zhì)量比的 0.10%, 0.25%,0.50%, 1.00%, 1.50%和2.00%作為添加量, 測(cè)得的魚丸解凍失水率如圖3所示。
圖3 不同多糖添加量對(duì)魚丸保水性的影響Fig. 3 Effects of different amounts of polysaccharides on the water-holding capacity of fish meatballs
其中殼聚糖1號(hào)在0.25%添加量時(shí)魚丸的解凍失水率最低, 之后隨著添加量的增加, 解凍失水率升高并趨于平衡; 在殼聚糖2號(hào)和海藻酸鈉組中, 隨著添加量的增加, 魚丸的解凍失水率降低, 在1.00%時(shí)解凍失水率達(dá)到最低值, 之后隨著添加量的增加, 解凍失水率升高。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)最終確定殼聚糖1、殼聚糖2號(hào)和海藻酸鈉的最優(yōu)添加量分別為 0.25%, 1.00%和 1.00%。該結(jié)論與部分學(xué)者的研究結(jié)果相似, 李寶升等[18]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合食品添加劑焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉、殼聚糖的最佳配比為0.15%∶0.10%∶1.00%時(shí), 豬肉保水保鮮效果最佳; 程琳麗等[19]研究發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉濃度為0.7%時(shí), 對(duì)羅非魚片的保水效果最優(yōu)。
2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
響應(yīng)面優(yōu)化法是一種尋求最佳組合條件的試驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)技術(shù), 通過對(duì)過程的回歸擬合和響應(yīng)曲面、等高線的繪制、可方便地求出相應(yīng)于各因素水平的響應(yīng)值[20],本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面分析, 根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理, 采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法, 對(duì)殼聚糖1、殼聚糖2號(hào)和海藻酸鈉的添加量進(jìn)行優(yōu)化, 試驗(yàn)方案及結(jié)果見表1。
表1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Tab. 1 Experimental design and response surface analysis results
如表 1所示, 試驗(yàn)方案共包括 17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn), 其中5個(gè)零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn), 進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)用以估算試驗(yàn)誤差。該試驗(yàn)對(duì)三種海洋多糖的添加量進(jìn)行復(fù)配優(yōu)化, 解凍失水率的范圍在1.41%~1.96%。
2.4.2 回歸方程的建立及統(tǒng)計(jì)分析
采用 Design-Expert 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析, 其中解凍失水率用Y值表示, 殼聚糖1、殼聚糖2號(hào)和海藻酸鈉的添加量分別用A, B, C表示, 得到三種多糖添加量的實(shí)際值對(duì)Y值的二次回歸方程如下:
回歸模型方差分析結(jié)果見表 2, 模型P值小于0.0001, 表明該回歸模型極顯著, 使用該方程模擬三因素三水平的分析是可行的。方程中A,C,A2,B2,C2對(duì)魚丸的保水率有極顯著性影響(P<0.001),B對(duì)魚丸的保水率有非常顯著性影響(P<0.01),AB,AC對(duì)魚丸的保水率有顯著性影響(P<0.05), 表明試驗(yàn)因素及二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響較大, 交互項(xiàng)作用對(duì)響應(yīng)值的影響想對(duì)較小。模型的相關(guān)系數(shù)為 99.78%, 說明模型擬合程度良好, 試驗(yàn)誤差小。綜上所述, 該模型方程可用來分析和預(yù)測(cè)不同多糖添加量復(fù)配對(duì)魚丸保水性的影響。
表2 二次回歸模型方差分析Tab. 2 Analysis of variance for quadratic response surface model
2.4.3 響應(yīng)曲面分析及優(yōu)化
根據(jù)二次回歸方程建立響應(yīng)面分析圖, 通過響應(yīng)面的曲面性狀[21], 分析殼聚糖1、殼聚糖2號(hào)和海藻酸鈉的添加量對(duì)魚丸保水性的影響。
圖4表示海藻酸鈉添加量為1.00%時(shí), 殼聚糖1號(hào)和殼聚糖2號(hào)對(duì)魚丸保水性的影響。當(dāng)殼聚糖2號(hào)添加量一定時(shí), 魚丸的解凍失水率隨著殼聚糖1號(hào)添加量的增加先緩慢降低, 約在 0.30%左右達(dá)到最低值,在 0.30%~0.45%添加量范圍內(nèi), 解凍失水率變化趨于平緩; 當(dāng)殼聚糖 1號(hào)添加量一定時(shí), 魚丸的解凍失水率隨著殼聚糖 2號(hào)添加量的增加先緩慢降低, 約在1.10%左右達(dá)到最低值, 之后隨著添加量從 1.10%增加到1.50%, 解凍失水率呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)。
圖4 殼聚糖1號(hào)和殼聚糖2號(hào)對(duì)魚丸保水性影響的響應(yīng)面圖Fig. 4 Response surface plots showing the effects of chitosan 1 and chitosan 2 on the water-holding capacity of fish meatballs
解萬翠等[22]研制出的羧甲基殼聚糖復(fù)配對(duì)蝦保水保鮮劑, 其含有0.3%羧甲基殼聚糖、0.05%Nisin、0.3%植酸鈉和 0.3%魔芋寡糖, 該保鮮保水劑可將對(duì)蝦貨架期延長3~4 d。其研究的保水保鮮劑中殼聚糖的最優(yōu)添加量僅為 0.3%, 可能因素是其復(fù)配的其他原料起到了協(xié)同保水保鮮的作用。
圖5表示殼聚糖2添加量為1.00%時(shí), 殼聚糖1號(hào)和海藻酸鈉對(duì)魚丸保水性的影響。當(dāng)殼聚糖1號(hào)添加量一定時(shí), 魚丸的解凍失水率隨著海藻酸鈉添加量的增加顯著降低, 約在 0.90%左右達(dá)到最低值,而在 0.90%~1.50%的添加量區(qū)間, 其解凍失水率顯著增加, 從圖中可以看出海藻酸鈉對(duì)解凍失水率的曲線很陡峭, 說明海藻酸鈉的添加量對(duì)魚丸解凍失水率的影響較大; 當(dāng)海藻酸鈉添加量一定時(shí), 魚丸的解凍失水率隨著殼聚糖 1號(hào)添加量的增加先緩慢降低, 約在0.25%左右達(dá)到最低值, 之后隨著添加量從0.25%增加到0.45%, 解凍失水率變化趨于平緩。
圖5 殼聚糖1號(hào)和海藻酸鈉對(duì)魚丸保水性影響的響應(yīng)面圖Fig. 5 Response surface plots showing the effects of chitosan 1 and sodium alginate on the water-holding capacity of fish meatballs
圖6 表示殼聚糖1添加量為0.25%時(shí), 殼聚糖2號(hào)和海藻酸鈉對(duì)魚丸保水性的影響。當(dāng)殼聚糖2號(hào)添加量一定時(shí), 海藻酸鈉的添加量 0.50%增加到1.50%, 魚丸的解凍失水率先急劇下降到最低點(diǎn), 約為 1.40%, 然后急劇升高至 1.85%左右, 變化趨勢(shì)較明顯; 當(dāng)海藻酸鈉添加量一定時(shí), 解凍失水率隨著殼聚糖1號(hào)添加量的增加先緩慢降低, 約在1.00%左右達(dá)到最低值, 之后隨著添加量從 1.00%增加到1.50%, 魚丸的解凍失水率呈緩慢增加趨勢(shì)。
圖6 殼聚糖2號(hào)和海藻酸鈉對(duì)魚丸保水性影響的響應(yīng)面圖Fig. 6 Response surface plots showing the effects of chitosan 2 and sodium alginate on the water-holding capacity of fish meatballs
根據(jù)響應(yīng)面軟件分析, 得到三種多糖的最佳復(fù)配值為: 殼聚糖1號(hào)添加量為0.29%, 殼聚糖2號(hào)添加量為 1.11%, 海藻酸鈉添加量為 0.93%, 在此條件下得到的魚丸解凍失水率的預(yù)測(cè)值為1.40%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性, 采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn), 測(cè)得的魚丸解凍失水率為 1.46%±0.24%,預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值無顯著性差異(P<0.05), 說明該響應(yīng)面法所得的優(yōu)化參數(shù)準(zhǔn)確可靠, 得到的多糖最佳復(fù)配值具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。此外, 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了同等添加量的磷酸鹽保水劑對(duì)魚丸的保水性, 其解凍失水率為1.31%±0.17%, 略低于多糖優(yōu)化組, 但無顯著性差異(P<0.05)。
為了進(jìn)一步研究海洋生物多糖對(duì)魚丸的保水作用, 我們采用掃描電鏡觀測(cè)魚丸的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)。從圖 7可以看出, 樣品經(jīng)放大 50倍, 肉眼可見空白組有較多大小不均一的孔隙, 說明其結(jié)構(gòu)較為疏松,可以推測(cè)其持水性較差, 多糖優(yōu)化組和磷酸鹽組的結(jié)構(gòu)較為致密, 無明顯孔隙; 樣品經(jīng)放大 200倍觀察,可見空白組結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)鱗片狀, 感覺較為松脆, 可以推測(cè)其硬度較小, 多糖優(yōu)化組和磷酸鹽組結(jié)構(gòu)分布較為均勻, 切面光滑且鱗片較少, 證明其彈性較足[23]。
圖7 魚丸的掃描電子顯微鏡圖Fig. 7 SEM images of fish meatballs
本實(shí)驗(yàn)以解凍失水率為響應(yīng)值, 通過對(duì)海洋生物多糖/寡糖進(jìn)行篩選, 確定殼聚糖1號(hào), 殼聚糖2號(hào)和海藻酸鈉為魚丸保水劑的主成分。經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定殼聚糖1號(hào), 殼聚糖2號(hào)和海藻酸鈉的最佳復(fù)配值為0.29%, 1.11%和0.93%, 按照最優(yōu)復(fù)配值添加到魚糜原料中, 測(cè)得魚丸的解凍失水率為 1.46%±0.24%, 說明該多糖復(fù)配值對(duì)魚丸制品具有較好的保水性。掃描電鏡觀察多糖組魚丸的微觀結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)致密, 無較大孔隙, 推測(cè)其硬度和彈性較好。綜上所述, 與傳統(tǒng)的磷酸鹽保水劑相比, 海洋生物多糖作為新一代保水劑更安全, 更健康, 通過本實(shí)驗(yàn)的開展, 為水產(chǎn)品的保水保鮮劑的開發(fā)提供了新思路。