李 楊 徐清清 韓 璐 王迪瓊 齊寶坤

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030； 2.國家大豆工程技術(shù)研究中心， 哈爾濱 150030)

0 引言

豌豆分離蛋白(PPI)是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源，具有均衡的氨基酸組分，含有大量賴氨酸，且成本低廉、易獲得，與其他豆類蛋白相比具有更低的致敏性[1]。PPI較差的水溶性限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。有研究表明，PPI在中性條件下具有良好的乳化活性，可作為食品工業(yè)中的新型乳化劑[2-3]。但是，在商業(yè)條件下提取的PPI制備乳液穩(wěn)定性較差[4]，限制了PPI在乳液中的應(yīng)用。因此，提高PPI乳液的穩(wěn)定性至關(guān)重要。

菊粉(Inulin, INU)是植物儲備性多糖，是一種可溶性膳食纖維[5]。目前，關(guān)于菊粉的研究主要集中在其益生元活性方面[6]，以及作為增稠劑、膠凝劑、糖和脂肪替代品等在食品工業(yè)的應(yīng)用方面[7]。近年來，菊粉在改善蛋白乳化性能方面取得了一些進展。有研究表明，低濃度的菊粉可以改善β-乳球蛋白的表面活性，對提高蛋白質(zhì)乳化性具有積極作用[8]；將菊粉與麥醇溶蛋白和麥谷蛋白混合，可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，以此提高蛋白質(zhì)的乳化性能[9]；低濃度INU可以顯著增強小麥蛋白的乳化活性[10]。目前關(guān)于INU對PPI的乳化性及乳液穩(wěn)定性的影響尚未見報道?；诖?，本文以PPI作為乳化劑，加入INU后，利用高壓均質(zhì)技術(shù)制備PPI/INU乳液，采用電位測定、粒徑測定、激光共聚焦顯微鏡(CLSM)、酶標(biāo)法和熒光光譜等技術(shù)對PPI乳化性及乳液穩(wěn)定性進行表征，以探討INU對PPI乳化性及乳液穩(wěn)定性的改善效果，為植物蛋白益生元乳液的制備提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆分離蛋白(PPI)，上海味慶生物科技有限公司；菊粉(平均聚合度為2～60，純度90%以上)，比利時ORAFTI公司；大豆油，重慶和而泰商貿(mào)有限公司；鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，北京新光化工試劑廠；BCA試劑盒，上海易色醫(yī)療科技有限公司；尼羅紅、尼羅藍(lán)，上海源葉有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型分析天平，梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司；FJ200-SH型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機，上海標(biāo)本模型廠；FB-110T型超高壓均質(zhì)機，上海勵途機械設(shè)備工程有限公司；LGR20-W型臺式高速冷凍離心機，北京京立離心機有限公司；Mastersizer2000型激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；Zetasizer Nano-ZS90型zeta電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；UV-5100型高性能紫外可見分光光度計，上海奧析科學(xué)儀器有限公司；DELTAVISION OMXSR型超分辨顯微鏡，德國徠卡公司；RF-5301PC型熒光分光光度計，日本島津公司；TecanM200型全自動酶標(biāo)儀，瑞士帝肯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1PPI/INU混合液制備

室溫(25℃)下，稱取2 g的PPI分散于100 mL磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH值7.0)中，300 r/min攪拌24 h，然后將PPI溶液置于5個不同的燒杯中，分別加入不同質(zhì)量的INU粉末，磁力攪拌(300 r/min)30 min確保充分溶解，使得混合液中PPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、1%、3%、5%和7%。

1.3.2PPI/INU乳液制備

將PPI/INU混合溶液與大豆油按體積比9∶1的比例混合，在室溫下勻速攪拌15 min，再經(jīng)高速剪切機(12 000 r/min，2 min)預(yù)均質(zhì)得到粗乳液，然后將粗乳液在70 MPa下高壓均質(zhì)1次得到終乳液。

1.3.3zeta電位測定

樣品裝入PCS8501型比色皿測定乳化性前，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.0)進行適度稀釋，采用Zetasizer Nano-ZS90型zeta電位分析儀測定樣品的zeta電位，在25℃下進行3次，乳液的相對折射率設(shè)置為1.095。

1.3.4粒徑和絮凝指數(shù)測定

參照文獻[11]的方法并略作修改，以去離子水和1%SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液為分散劑，其中，以水作為分散劑，可測得乳液中油滴絮凝體的粒徑分布；以1%SDS作為分散劑，可測得單個油滴的粒徑分布。然后使用Mastersizer2000型激光粒度儀測定樣品的粒徑分布和平均粒徑。樣品的相對折射率取1.095。以粒徑(nm)為橫坐標(biāo)，以各粒級油滴體積分?jǐn)?shù)(%)為縱坐標(biāo)，繪制油滴的粒徑分布曲線。絮凝指數(shù)FI計算公式為

(1)

式中d4,3-water、d4,3-SDS——乳液在水和1%SDS分散劑中的體積平均粒徑

1.3.5微觀結(jié)構(gòu)觀察

采用激光共聚焦顯微鏡對樣品的微觀結(jié)構(gòu)進行觀察。取2 mL樣品分別加入0.05 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的尼羅紅染料和1%的尼羅藍(lán)染料，混合均勻，避光反應(yīng)30 min。其中，樣品中的蛋白相和油相分別被尼羅藍(lán)和尼羅紅染色。樣品染色以后，選用10倍目鏡和60倍物鏡，采用Argon和He/Ne激光器為激發(fā)光源，激發(fā)波長分別設(shè)置為488、514 nm，進行觀察拍照。

1.3.6乳化性測定

根據(jù)文獻[12]，采用濁度法測定蛋白樣品的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。按照1.3.2節(jié)的方法制備乳液，在離燒杯底部0.5 cm處取15 μL剛制備好的乳液于5 mL 0.1%SDS溶液中，混勻后裝入玻璃比色皿，用紫外可見分光光度計在500 nm 處測定樣品吸光度，以0.1%SDS作空白對照。乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)計算公式為

(2)

(3)

式中EAI——乳化活性指數(shù)，m2/g

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

N——稀釋倍數(shù)，取200

C——乳液形成前蛋白溶液中蛋白質(zhì)量濃度，g/mL

Φ——乳液中油相體積分?jǐn)?shù)

A0——0 min時測定的吸光度

A10——10 min時測定的吸光度

1.3.7界面蛋白吸附率測定

參照文獻[13]的方法并稍作改動，取新鮮乳液在10 000g下離心30 min后，吸取下層清液過0.45 μm濾膜，然后將過濾后的下清液稀釋不同濃度梯度后用移液槍加入96孔酶標(biāo)板，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用BCA法測定未吸附層中的蛋白質(zhì)量濃度。界面蛋白吸附率計算公式為

(4)

式中C0——制備乳液的蛋白溶液中的蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL

CS——乳液離心后未吸附層(下清層+沉淀層)中的蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL

1.3.8內(nèi)源熒光光譜分析

混合溶液用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.0)稀釋至3.0 mg/mL，裝入石英比色皿中，采用熒光光度計測定PPI的內(nèi)源熒光光譜。激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長為300～500 nm，狹縫寬度為5 nm。

1.3.9儲藏過程平均粒徑測定

參照文獻[14]的方法，將制備好的乳液立即分裝到可密封的離心管中，蓋緊密封后將乳液于室溫下放置30 d，每隔一定時間(0、3、6、9、15、21、30 d)測定乳液的粒度變化。

1.3.10儲藏過程乳析指數(shù)測定

將制備的乳液(5 mL)注入玻璃比色管中(高140 mm，內(nèi)徑為15 mm)，用瓶蓋密封，在常溫下垂直儲藏30 d，觀察并記錄乳液的分層情況[15]。乳液的乳析程度由乳析指數(shù)(Creaming index，CI)表示，公式為

(5)

式中Hs——乳清層高度，mm

He——乳液總高度，mm

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著水平為p<0.05。采用SPSS軟件對數(shù)值進行方差分析。采用Origin 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 添加INU對zeta電位的影響

乳液液滴之間的靜電排斥是影響乳液穩(wěn)定性的一個重要因素，因為液滴表面電荷可以在液滴之間產(chǎn)生足夠強的排斥力以使乳液靜電穩(wěn)定[16]。隨著INU濃度的增加，乳液zeta電位絕對值呈先增大后減小的趨勢，添加1%INU時zeta電位絕對值最大(為34.03 mV)，與PPI乳液相比增加了3.5 mV，這可能與少量INU的添加導(dǎo)致界面處吸附的蛋白質(zhì)含量增加有關(guān)。有研究表明，油滴上吸附更多的乳清蛋白可以增加zeta電位[17]，即乳液穩(wěn)定性有所提高。而繼續(xù)提高INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)，zeta電位絕對值開始減小，當(dāng)添加至7%時乳液的zeta電位絕對值最小(為26.80 mV)?？傻贸?%INU可以顯著增加乳液zeta電位，此時乳液穩(wěn)定性最好，繼續(xù)增加INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)反而會減小乳液的zeta電位絕對值，進而降低乳液穩(wěn)定性，當(dāng)INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至7%時乳液穩(wěn)定性最差。

2.2 添加INU對平均粒徑和絮凝指數(shù)的影響

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的INU對PPI乳液平均粒徑和絮凝指數(shù)的影響如圖1(圖中不同大、小字母分別表示各參數(shù)的數(shù)值差異顯著，下同)所示。所有乳液的粒徑都低于1 μm，表明所研究的乳液在一定時間內(nèi)具有一定的穩(wěn)定性。有研究表明，乳狀液中液滴的大小對其穩(wěn)定性(如重力分離、絮凝和聚結(jié))有很大影響，一般擁有越小平均粒徑的乳液穩(wěn)定性越好[18]。僅使用PPI制備的乳液粒徑在411.40 nm左右，表明單獨的PPI可以制備乳液。然而，此時乳液的絮凝指數(shù)較大，說明乳液穩(wěn)定性不好。含1%INU的乳液具有最小體積平均粒徑d4,3(395.50 nm)，與單獨PPI制備的乳液粒徑相比略有減少，此時絮凝指數(shù)從原來的2.67%降至0.66%，乳液穩(wěn)定性顯著增強，這可能是加入少量菊粉后液滴表面的負(fù)電荷增加所致。當(dāng)INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至3%時，粒徑為400.80 nm，絮凝指數(shù)開始增大，但均小于單獨PPI制備的乳液，表明加入1%和3%菊粉后，乳液穩(wěn)定性有所增強。隨著INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加至5%和7%時，乳液粒徑明顯增大，分別為421.47 nm和435.40 nm，均大于單獨的PPI乳液，這可能是因為加入較高濃度的菊粉后連續(xù)相粘度增加，已有文獻表明較大液滴的產(chǎn)生與連續(xù)相粘度增加有關(guān)[19]，并且觀察到絮凝指數(shù)分別從PPI乳液的2.67%增加至11.44%和13.95%，說明此時乳液穩(wěn)定性降低。

圖1 添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)INU的PPI乳液平均粒徑和絮凝指數(shù)Fig.1 Average particle size and flocculation index of PPI emulsions with different concentrations of INU

2.3 添加INU對乳液微觀結(jié)構(gòu)及粒徑分布的影響

采用激光共聚焦顯微鏡觀察乳液液滴的形態(tài)，其中綠色代表染色后的蛋白質(zhì)，紅色代表油滴。采用激光粒度儀獲得乳液粒徑分布(插入線)。圖2顯示，乳液的液滴尺寸隨添加INU濃度的增加而增大。僅由PPI制備的乳液液滴分布比較均勻，說明在高壓均質(zhì)條件下，PPI可以作為乳化劑應(yīng)用于乳液中，但部分油滴發(fā)生了聚集，說明僅有PPI制備的乳液穩(wěn)定性較差。CLSM顯示低濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%和3%)的INU使乳液液滴分布更均勻，說明此時PPI乳化性和乳液穩(wěn)定性均得到改善，可能是因為該濃度下的INU增強了液滴間的靜電排斥力。當(dāng)加入5%的INU時，液滴尺寸開始顯著增大，直至加入7%的INU后，觀察到液滴發(fā)生明顯聚集，這可能是連續(xù)相的高粘度所致[19]。從粒徑分布來看，所有乳液都呈現(xiàn)雙峰分布，加入低濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%和3%)INU后，粒徑分布向左發(fā)生了偏移，在較小粒徑(60～164 nm)下出現(xiàn)增長的粒徑分布峰，且粒徑分布變窄，說明PPI乳化性和乳液穩(wěn)定性變好。當(dāng)繼續(xù)增加INU含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%和7%)，此時粒徑分布比單獨PPI制備的乳液寬，粒徑分布向右發(fā)生了偏移，在3 580～6 440 nm處出現(xiàn)較大粒徑分布峰，表明液滴發(fā)生了明顯的聚集，乳液穩(wěn)定性變差。圖中粒徑分布與CLSM結(jié)果一致。

圖2 添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)INU的PPI乳液激光共聚焦顯微結(jié)構(gòu)和粒徑分布圖Fig.2 CLSM and particle size distribution of PPI emulsions with different concentrations of INU

2.4 乳化性分析

蛋白質(zhì)的乳化活性取決于一系列復(fù)雜因素，包括蛋白質(zhì)的兩親性質(zhì)和界面活性、蛋白質(zhì)溶解度和遷移率(即單個蛋白質(zhì)分子快速移動到界面的能力)[20]。乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)是衡量乳化性能的兩種常用的指標(biāo)，乳化活性指數(shù)是蛋白質(zhì)吸附到界面能力的量度，而乳化穩(wěn)定性指數(shù)表征在限定時間段內(nèi)吸附層的穩(wěn)定性[21]。圖3中單獨的PPI乳液乳化活性指數(shù)為(14.04±0.09) m2/g，當(dāng)乳液的INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時，PPI的乳化活性指數(shù)最大，比未添加INU時增加7.8%左右，說明該濃度的INU對乳液的乳化活性具有顯著的改善作用，這可能是因為INU的強吸水性和不結(jié)合蛋白質(zhì)的能力，導(dǎo)致乳液體系內(nèi)部水分的變化以及蛋白質(zhì)之間的氫鍵和范德華力的破壞，較松散的蛋白質(zhì)分子和較大的表面積增強了側(cè)鏈親水基團與水的相互作用，增加了蛋白質(zhì)的溶解度[9]。INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時PPI的乳化活性指數(shù)較1%的低，但比起單獨的PPI乳液，其乳化活性指數(shù)增加約3.8%。隨著INU含量繼續(xù)增加，PPI的乳化活性指數(shù)呈下降趨勢，當(dāng)乳液中的INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到7%時，乳化活性指數(shù)變得不如單獨的PPI乳液。添加1%和3%INU分別使PPI乳液的ESI增加了22%和9.9%，效果顯著，可能是因為連續(xù)相粘度的相對增加抑制了分散相的流動性而有利于穩(wěn)定性。相反，5%和7%的高濃度INU使PPI乳液的乳化穩(wěn)定性指數(shù)降低，可能是因為連續(xù)相中INU濃度過高，使得連續(xù)相中PPI-INU復(fù)合物的生成量增加導(dǎo)致參與界面蛋白濃度降低，液滴發(fā)生了絮凝。這與2.2節(jié)中在該INU濃度下乳液液滴尺寸增大相一致。

圖3 添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)INU的PPI乳液乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)Fig.3 Emulsification activity index and emulsification stability index of PPI emulsions with different concentrations of INU

2.5 添加INU對界面蛋白吸附率的影響

乳液的穩(wěn)定性強烈依賴于蛋白質(zhì)在油/水界面處的吸附并形成穩(wěn)定的粘彈性膜的能力，從而降低界面張力并穩(wěn)定油滴以防止聚結(jié)。在考察INU濃度對PPI乳液的界面蛋白吸附率的影響時，發(fā)現(xiàn)1%和3%INU對蛋白質(zhì)的界面吸附率具有積極影響，分別使界面蛋白吸附率增加11%和8.4%左右。盡管INU不具有表面活性，但INU的存在可能有利于蛋白吸附動力學(xué)，這主要歸因于兩種生物聚合物有限的熱力學(xué)相容性，導(dǎo)致INU濃縮了界面吸附的蛋白質(zhì)[22]。但是，當(dāng)INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高為5%時，乳液的界面蛋白吸附率降低了6.2%，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高至7%時，界面蛋白吸附率急劇下降，約降低7.8%，說明加入低濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%和3%)的INU能改善乳液的界面吸附性能，但高濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%和7%)的INU不適合應(yīng)用于PPI乳液中。這可能是因為連續(xù)相中存在較多INU會結(jié)合更多的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致連續(xù)相中的蛋白質(zhì)含量增多[23]，從而導(dǎo)致界面蛋白處吸附的蛋白質(zhì)減少，乳液穩(wěn)定性降低。該結(jié)果與zeta電位結(jié)果一致。

2.6 熒光光譜分析

熒光光譜法是檢測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化以及復(fù)合物形成的有效方法。當(dāng)激發(fā)波長為295 nm時，蛋白質(zhì)中的Trp殘基被激發(fā)，這強烈依賴于蛋白質(zhì)的解折疊程度[24]。從圖4可以看出，隨著INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，熒光強度逐漸降低，說明PPI發(fā)生了熒光猝滅反應(yīng)。PPI的Trp殘基最大熒光發(fā)射峰在334 nm處，當(dāng)加入1%和3%的INU時，最大峰值沒有發(fā)生偏移，說明INU沒有使PPI的Trp殘基微環(huán)境發(fā)生變化。研究表明，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與多糖發(fā)生相互作用時，Trp殘基的熒光發(fā)射會發(fā)生熒光猝滅和峰位偏移[25]。可以看出加入5%和7%的INU后，Trp殘基的最大熒光發(fā)射峰發(fā)生了紅移(從334 nm到337 nm)，表明Trp殘基周圍的極性增加，疏水性略有下降，可得出：隨著INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，連續(xù)相中PPI-INU復(fù)合物的生成量增多，這對乳液的穩(wěn)定性產(chǎn)生了負(fù)面影響，這與之前研究的zeta電位絕對值結(jié)果相一致。即使INU不具有表面活性，但不能排除連續(xù)相中蛋白/多糖復(fù)合物的存在，這種復(fù)合物是由帶正電荷的蛋白質(zhì)聚集體與多糖之間的弱靜電相互作用或氫鍵穩(wěn)定下來的，后者在中性多糖中占優(yōu)勢，如INU[26]。

圖4 添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)INU的連續(xù)相熒光強度Fig.4 Fluorescence intensity of continuous phase with different concentrations of INU

2.7 乳液儲藏穩(wěn)定性分析

由圖5可知，隨著儲藏時間的延長，所有乳液的體積平均粒徑d4,3增加，這可歸因于界面處蛋白質(zhì)重排和油滴之間相互作用引起的液滴聚集[27]，但含1%和3%INU的乳液d4,3增加較少。所有乳液在6 d內(nèi)具有較好的儲藏穩(wěn)定性，因為在儲藏初期，液滴表面的界面膜在乳液穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用，這取決于蛋白質(zhì)在油/水界面處的吸附及形成穩(wěn)定的粘彈性膜的能力。30 d后未添加INU的乳液有較明顯的乳清層，其乳析指數(shù)約為14.38%。加入濃度為1%和3%INU后，雖然乳液在30 d后開始變得不均一，但只出現(xiàn)了輕微的乳析現(xiàn)象，說明添加1%～3%的菊粉可以起到改善乳液儲藏穩(wěn)定性的作用。但當(dāng)INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過3%時，乳液儲藏穩(wěn)定性比單獨的PPI乳液更差，并且可觀察到INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%和7%時乳析指數(shù)明顯增大(達(dá)17.14%和22.76%)，對乳液的穩(wěn)定性產(chǎn)生了負(fù)面影響，這可能是因為INU的強親水性使其吸附了大量自由水，使蛋白質(zhì)分子不能吸水舒展，疏水基團不能分離[28]。

圖5 乳液儲藏30 d過程中的體積平均粒徑及儲藏30 d后的乳析指數(shù)和乳液外觀Fig.5 Volume average particle size of emulsions during storage for 30 d together with creaming index and emulsion appearance after storage for 30 d

3 結(jié)束語

添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的INU會影響PPI的乳化性及乳液的穩(wěn)定性。加入1%INU后，乳液具有最大zeta電位絕對值(為34.03 mV)和最小平均粒徑(d4,3為395.50 nm)；CLSM顯示，低濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%和3%)的INU使乳液液滴分布更均勻，說明此時PPI乳化性和乳液穩(wěn)定性均得到改善；INU質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時，分別使PPI的乳化活性指數(shù)增加了7.8%、乳化穩(wěn)定性指數(shù)增加了22%、界面蛋白吸附率增加了11%；熒光光譜顯示，隨著INU濃度的增加，連續(xù)相中PPI-INU復(fù)合物的生成量增多，對乳液的穩(wěn)定性產(chǎn)生了負(fù)面影響。由此可得低濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%和3%)的INU可改善PPI的乳化性、提高PPI乳液的穩(wěn)定性，添加1%的INU效果最顯著。