曹云剛 王 凡 艾娜絲 劉樹興 馬文慧 黃峻榕

(1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院， 西安 710021； 2.北京工商大學(xué)北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100048；3.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心， 北京 100048)

0 引言

肉制品是人類膳食的重要組成部分，不僅能提供蛋白質(zhì)，同時也是脂類、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源[1]。肉制品富含飽和脂肪酸和膽固醇，其過量攝入被認為與肥胖、高血壓、高血脂、冠心病等疾病有直接關(guān)系[2-3]。直接去除脂肪會造成肉制品品質(zhì)下降，引起消費者排斥。因此，選用一種合適的脂肪替代物至關(guān)重要。

膳食纖維是一種不被人體小腸消化吸收、在大腸內(nèi)能部分或全部發(fā)酵的多糖，對預(yù)防高血壓、高血脂、肥胖等疾病有一定的作用。同時，膳食纖維具有很強的吸水性、持油性、保水性以及膨脹性[4-5]。近年來，已有不少研究將膳食纖維添加至低脂肉制品中，以提高肉制品的品質(zhì)或代替脂肪，減少熱量的攝入，提高人體健康，如甘蔗膳食纖維[6]、小麥麩皮膳食纖維[4]、瓜爾-黃原膠[7]等。但現(xiàn)有研究結(jié)果并不一致，相關(guān)機制仍需進一步探索。

肌原纖維蛋白是肉制品中含量最高、最重要的蛋白質(zhì)，決定著肉的加工性能及肉制品的品質(zhì)[8]。目前，關(guān)于膳食纖維對肌原纖維蛋白凝膠性能影響的研究較少，尤其是蘋果膳食纖維對其影響的相關(guān)研究尚未見報道。我國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國和消費國，蘋果汁的消費也日益增長。蘋果汁加工副產(chǎn)物蘋果渣中含有大量的膳食纖維，不溶于水、無味無害、有益于健康。目前，蘋果渣除極少部分被用于飼料和深加工外，絕大部分被丟棄，既浪費資源又污染環(huán)境，因此蘋果渣亟待深度應(yīng)用開發(fā)。如果能將蘋果膳食纖維合理應(yīng)用于肉制品加工中，既能提高肉制品的健康性，又能拓寬蘋果渣的應(yīng)用范圍。為此，本文探究不同含量蘋果膳食纖維(Apple dietary fiber，ADF)對肌原纖維蛋白(Myofibrillar protein，MP)凝膠性能的影響，為蘋果膳食纖維作為添加劑或脂肪替代物在肉制品中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

豬外脊肉(Longissimuslumborum)，購于陜西省西安市未央?yún)^(qū)潤家超市，置于冰盒中運回實驗室，剔除可見脂肪組織后，垂直于肌纖維走向切成100 g左右的肉排，真空包裝，置于-18℃冷凍備用。

乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、二硫蘇糖醇(DTT)等，購于生工生物工程(上海)股份有限公司；ADF直徑小于0.074 mm，由陜西嘉禾生物科技股份有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

HR/T20MM型立式高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；CP213型電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；PHS-25型數(shù)顯pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TA.Plus型物性測試儀，英國Stable Micro System公司；Mini-PROTEAN 3 Cell型電泳儀，美國Bio-Rad公司；CM-5型分光測色計，柯尼卡美能達(中國)投資有限公司；Thermo Scientific-HAAKE Mars60型流變儀、Thermo Scientific-DXR 2xi型顯微拉曼成像光譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司；FEI Q45+EDAX Octane Prime型掃描電鏡，美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1肌原纖維蛋白的提取

參照文獻[9]的方法進行肌原纖維蛋白的提取。將冷凍肉在4℃下靜置12 h進行解凍，用刀將豬外脊肉切成若干小條稱量，放置于組織搗碎機中，加入4倍體積的僵直液(0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L Na3PO4，1 mmol/L EGTA，pH值7.0)，進行勻漿搗碎(15 s，4次)，離心15 min(2 000g，4℃)，棄上層液，所得沉淀再次加入4倍體積的僵直液，重復(fù)上述步驟共3次。所得沉淀加入4倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液，攪拌均勻后經(jīng)紗布過濾，使用0.1 mol/L HCl將濾液的pH值調(diào)至6.25，離心，所得沉淀即為MP。全部提取過程保持在0～4℃，將所得蛋白置于離心杯中，保存于碎冰中，并保證在48 h內(nèi)使用。采用雙縮脲法測定蛋白濃度。

1.3.2肌原纖維蛋白-膳食纖維混合體系的制備

使用25 mmol/L pH值6.2的磷酸鹽緩沖液(含0.4 mol/L NaCl)將MP蛋白膏稀釋為45 mg/mL，分別加入不同含量的ADF，用上述緩沖液對體系進行稀釋，使得最終蛋白質(zhì)量濃度為30 mg/mL，ADF添加量(占蛋白質(zhì)量分數(shù))分別為0、1%、2%、3%、5%、10%、20%和50%，用玻璃棒輕輕攪拌均勻，將樣品放置4℃下儲存12 h。

1.3.3十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參照文獻[10]的方法，用25 mmol/L pH值6.2的磷酸鹽緩沖液(含0.4 mol/L NaCl)稀釋肌原纖維蛋白-膳食纖維混合體系，使其中蛋白最終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，與等體積電泳樣品稀釋緩沖液混勻后，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(SDS-PAGE)法分別在還原和非還原條件下對蛋白交聯(lián)和聚集進行電泳分析，其濃縮膠和分離膠的質(zhì)量分數(shù)分別為4%和12%，每孔上樣量20 μg。然后染色、脫色、拍照，并對電泳條帶進行分析。

1.3.4流變學(xué)性能的測定

根據(jù)文獻[11]的方法進行動態(tài)流變學(xué)的測定。將樣品混合物置于塑料離心管中離心(4℃，1 000g，1 min)脫氣，將脫氣后的樣品置于間距為1 mm的流變儀平板之間，下壓后輕輕拭去平板周圍多余的樣品，用硅油進行密封，防止水分的流失，平衡2 min，在振蕩模式下使樣品以1℃/min的升溫速率從20℃加熱至75℃后開始凝膠化。其振蕩頻率為0.1 Hz，最大應(yīng)變?yōu)?.02。記錄實驗中的彈性模量G′作為評價指標。

1.3.5熱誘導(dǎo)凝膠的制備

準確稱取5 g上述混合物樣品置于小玻璃瓶中，封口，將其放置水浴鍋中，以1℃/min的速度從20℃加熱至75℃，且在75℃保溫10 min，取出后立即放置冰水浴中冷卻30 min，將所得凝膠于4℃冰箱中靜置12 h[12]。測定凝膠性能前，需將凝膠樣品在室溫(20℃)下平衡2 h。

1.3.6蒸煮損失

用小鏟輕輕將凝膠與瓶壁剝離，并倒扣于濾紙上，靜置20 min，使其蒸煮汁液流盡之后，對凝膠進行稱量[13]。蒸煮損失率C計算公式為

(1)

式中M0——蒸煮前溶膠質(zhì)量

M1——蒸煮后溶膠質(zhì)量

1.3.7凝膠白度

凝膠白度測定參照文獻[14]方法，略作修改。使用分光測色計進行測定，通過儀器的自檢及零點、白板的校正之后，開始測定樣品。每個樣品做3組平行，取其平均值。凝膠白度W計算公式為

(2)

式中L*——亮度

a*——紅度(正值表示偏紅，負值表示偏綠)

b*——黃度(正值表示偏黃，負值表示偏藍)

1.3.8凝膠質(zhì)構(gòu)

采用TPA質(zhì)構(gòu)分析法[15]，測定凝膠的硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性和回復(fù)性等指標。使用小鏟子輕輕將凝膠與小玻璃瓶壁剝離，將凝膠取出放置于平板上進行質(zhì)構(gòu)測定。測定參數(shù)設(shè)置如下：測前、測中、測后速率均為2 mm/s；下壓百分比30%；兩次下壓時間間隔5 s；探頭型號P/75；觸發(fā)力10 g。

1.3.9拉曼光譜

參照文獻[16]的方法略微修改。拉曼數(shù)據(jù)采集參數(shù)設(shè)置如下：顯微拉曼成像光譜儀波長785 nm；激光功率35 mW；10×/0.25 BD顯微鏡；孔徑50 μm；估計分辨率4.7～8.7 cm-1；估計光斑直徑3.1 μm；收集曝光時間30 s；樣品曝光次數(shù)3次。光譜數(shù)據(jù)由OMNIC軟件收集，使用LabSpec軟件對所得光譜進行平滑、基線校正以及在1 003 cm-1處的苯丙氨酸帶進行歸一化處理。

1.3.10凝膠微觀結(jié)構(gòu)

參照文獻[17]的方法稍加修改，借助掃描電鏡對凝膠微觀結(jié)構(gòu)進行觀察。使用刀片將凝膠樣品切塊(3 cm×3 cm×3 cm)，用含2.5%戊二醛的0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液固定4 h后，用磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)清洗3次，隨后依次在體積分數(shù)為50%、70%、90%、95%和100%的乙醇中浸泡30 min進行脫水，在-70℃冷凍干燥后對樣品噴金，并使用掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)，加速電壓為15 kV，放大倍數(shù)3 500倍。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組實驗重復(fù)2～3次，采用Statistix 9.0分析軟件進行方差分析和顯著性分析，P<0.05時差異顯著；采用SigmaPlot 12.5軟件進行數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MP混合溶膠中蛋白交聯(lián)聚集

通過SDS-PAGE分析ADF添加量對MP交聯(lián)聚集的影響(圖1)。在非還原條件(圖1a)，隨著ADF添加量的增加，分離膠中MP樣品的肌球蛋白重鏈(MHC)和肌動蛋白(Actin)條帶等并沒有發(fā)生明顯變化，同時濃縮膠頂端的大分子聚合物條帶也基本相似。在還原條件(加入DTT后，圖1b)，濃縮膠頂端的聚合物條帶明顯減少，同時分離膠中MHC和Actin條帶明顯加粗，說明在非還原條件下形成的聚合物中主要包含肌球蛋白重鏈和肌動蛋白，并且這些聚合物主要是通過二硫鍵交聯(lián)而成的，但仍有極少部分聚集物條帶并沒有消失，表明聚合物中可能有其他共價鍵存在[11]。綜合上述分析可知，ADF添加對MP的交聯(lián)聚集幾乎沒有影響，且二者之間不存在共價交聯(lián)。

2.2 MP動態(tài)流變行為

不同ADF添加量對混合凝膠彈性模量G′的影響如圖2所示。ADF添加量為1%～20%時，其G′曲線極其接近，導(dǎo)致曲線之間過度重疊，為便于分析與閱讀，此處選擇ADF添加量為20%的G′曲線作為代表性曲線。未添加ADF的MP樣品的G′在44～53℃范圍內(nèi)顯著上升，這是因為肌球蛋白頭部的變性及交聯(lián)，從而形成較弱的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；53～61℃急劇下降，這是由于肌球蛋白的尾部展開破壞了已形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；在最后的加熱過程中(61～75℃)G′隨溫度升高持續(xù)上升，說明蛋白質(zhì)進一步發(fā)生交聯(lián)聚集，最終形成了永久性、不可逆的、更強的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[18-19]。不同文獻報道中MP在加熱過程中的熱轉(zhuǎn)變峰值存在差異[20]，這可能與實驗所用豬外脊肉、實驗條件等的不同有關(guān)。低ADF添加量(1%～20%)對MP彈性模量無顯著影響，加熱終點(75℃)的G′與對照基本一致。高ADF添加量(50%)完全破壞了MP在加熱過程中的凝膠網(wǎng)絡(luò)形成，導(dǎo)致整個加熱過程中混合體系的G′都非常低。這可能是由于ADF含量過大，其吸水溶脹后嚴重阻礙了蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)。

圖2 ADF添加量對加熱過程中混合溶膠彈性模量G′的影響Fig.2 Effect of ADF content on elastic modulus G′ of mixed sol during heating

2.3 MP混合凝膠蒸煮損失與凝膠白度

肉在蒸煮的過程中會造成水分、脂肪等的流失，此現(xiàn)象稱之為蒸煮損失[12]。不同ADF添加量對MP凝膠蒸煮損失率的影響如圖3(圖中不同字母表示差異顯著，下同)所示。未添加ADF的MP熱誘導(dǎo)凝膠的蒸煮損失率為14.96%，從統(tǒng)計學(xué)意義上看1%～5%的ADF添加量對MP熱誘導(dǎo)凝膠的蒸煮損失無明顯影響，但從數(shù)值上看添加5%ADF的混合凝膠具有最小的蒸煮損失率(14.44%)。當ADF添加量大于10%時，MP熱誘導(dǎo)凝膠的蒸煮損失率隨ADF添加量增大呈上升趨勢，當添加量為50%時，其蒸煮損失率增大至18.45%，與空白對照相比提升了23.32%。如前所述，添加50%的ADF嚴重破壞了MP凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，因而導(dǎo)致其蒸煮損失明顯增大。文獻[21]研究發(fā)現(xiàn)，添加大豆膳食纖維可使魚糜凝膠的蒸煮損失降低，不一致的實驗結(jié)果可能與實驗所用膳食纖維種類及添加量不同有關(guān)。

圖3 ADF添加量對熱誘導(dǎo)混合凝膠蒸煮損失率的影響Fig.3 Effect of ADF content on cooking loss rate of heat induced mixed gels

不同ADF添加量對MP凝膠白度的影響如圖4所示。隨著ADF添加量增加，所形成凝膠的白度呈逐漸下降趨勢；且當ADF添加量大于3%時，混合凝膠白度下降趨勢肉眼可見(P<0.05)，這是由于ADF本身具有顏色(棕色)。

圖4 ADF添加量對熱誘導(dǎo)混合凝膠白度的影響Fig.4 Effect of ADF content on whiteness of heat induced mixed gels

2.4 MP混合凝膠質(zhì)構(gòu)

根據(jù)美國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會委員會規(guī)定，食品的質(zhì)構(gòu)是指眼睛、口中的豁膜及肌肉所感覺到的食品的性質(zhì)，包括粗細、滑爽、顆粒感等。食品質(zhì)構(gòu)是與食品的組織結(jié)構(gòu)及狀態(tài)有關(guān)的物理性質(zhì)，其機械特性測定指標通常包括硬度、彈性指數(shù)、內(nèi)聚性指數(shù)、咀嚼性指數(shù)和回復(fù)性指數(shù)等。硬度是描述與食品變形或穿透產(chǎn)品所需的力有關(guān)的機械質(zhì)地特性，是食品保持形狀的內(nèi)部結(jié)合力。彈性指數(shù)表示物體在外力的作用下發(fā)生形變，撤去外力后可以恢復(fù)原來狀態(tài)的能力。內(nèi)聚性指數(shù)反映的是咀嚼食物時食物抵抗受損并緊密連接，可以使食物保持完整的性質(zhì)。咀嚼性指數(shù)是指與硬度、內(nèi)聚性和彈性有關(guān)，將固體食品咀嚼到可吞咽時需做的功的大小。回復(fù)性指數(shù)反映了食品以彈性變形保存的能量，表示變形樣品在與導(dǎo)致變形同樣的速度、壓力條件下回復(fù)的程度[22]。不同ADF添加量對MP混合凝膠質(zhì)構(gòu)的影響如表1所示。與對照相比，添加5%和20%ADF的MP熱誘導(dǎo)凝膠的內(nèi)聚性指數(shù)分別提高了17.9%和14.3%。除此之外，添加1%～20%的ADF對MP熱誘導(dǎo)凝膠的硬度、彈性指數(shù)和內(nèi)聚性指數(shù)幾乎無影響，當添加量為50%時，凝膠的硬度、彈性指數(shù)和內(nèi)聚性指數(shù)與對照相比分別下降了約30%、16%和34%。添加1%～10%的ADF對MP熱誘導(dǎo)凝膠的咀嚼性指數(shù)和回復(fù)性指數(shù)影響不顯著，但添加20%和50%的ADF顯著降低了凝膠的咀嚼性指數(shù)和回復(fù)性指數(shù)(P<0.05)，且ADF添加量越大負面效應(yīng)越明顯，當添加量為50%時，凝膠的咀嚼性指數(shù)和回復(fù)性指數(shù)與對照相比分別下降了約62%和52%。整體來看當ADF添加量低于10%時，對熱誘導(dǎo)凝膠的質(zhì)構(gòu)特性無負面影響，這與流變的實驗結(jié)果大體一致。綜合來看，添加5%ADF的MP熱誘導(dǎo)凝膠質(zhì)構(gòu)特性最好。

表1 ADF添加量對熱誘導(dǎo)混合凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Tab.1 Effect of ADF content on texture profile of heat induced mixed gels

2.5 MP混合凝膠中非共價相互作用

2.5.1疏水作用力

凝膠的拉曼光譜可以顯示出芳香族氨基酸側(cè)鏈的變化，可以提供局部環(huán)境下蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)信息，拉曼譜帶在760 cm-1處的歸一化強度與色氨酸殘基環(huán)的伸縮振動有關(guān)，可用于研究色氨酸殘基的微環(huán)境，進而反映蛋白質(zhì)凝膠的疏水相互作用[23]。如表2所示，隨ADF添加量增大，MP混合凝膠760 cm-1處歸一化強度整體呈增大趨勢，但當ADF添加量在0～20%之間時，歸一化強度并無顯著差異(P>0.05)。當ADF添加量達到50%，歸一化強度明顯增大，表明更多的色氨酸殘基處于較疏水的微環(huán)境中。這可能是由于ADF添加量過大，競爭性吸收了體系中大量的水分，阻礙了MP的水化，使得色氨酸殘基的微環(huán)境更加疏水。

2.5.2氫鍵

利用830 cm-1和850 cm-1附近的雙拉曼光譜可以監(jiān)測酪氨酸殘基周圍的微環(huán)境。酪氨酸雙峰比值(I850/I830)可用于檢測酪氨酸殘基是否暴露于溶劑中，其相對強度反映了氫鍵的性質(zhì)和酪氨酸側(cè)鏈中酚羥基的狀態(tài)[2,23]。當酪氨酸雙峰比值(I850/I830)在0.7～1.0之間時，通常表明酪氨酸殘基埋藏在蛋白分子中，當酪氨酸雙峰比值(I850/I830)在0.90～1.45之間時，則表明酪氨酸殘基暴露于溶劑當中[24-25]。如表2所示，所有混合凝膠的酪氨酸雙峰比值(I850/I830)均在1.0附近，表明酪氨酸殘基上的OH既與H2O2形成氫鍵又與蛋白質(zhì)上其他中性基團形成氫鍵；所有混合凝膠的酪氨酸雙峰比值(I850/I830)無顯著差異(P>0.05)，說明ADF添加對混合凝膠中的氫鍵無顯著影響。與本實驗結(jié)果類似，文獻[2]研究發(fā)現(xiàn)添加不同含量的甘蔗不溶性膳食纖維對MP混合凝膠中的氫鍵無顯著影響。

表2 ADF添加量對MP混合凝膠760 cm-1處歸一化強度及酪氨酸雙峰比值(I850/I830)的影響Tab.2 Effect of ADF content on normalization intensity 760 cm-1 band and I850/I830 band of mixed gels

2.6 混合凝膠微觀結(jié)構(gòu)

肌原纖維蛋白在加熱過程中會發(fā)生變性及聚集，最終形成緊致、細密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[2]。不同ADF添加量對MP混合凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響如圖5所示。從圖5可以看出，當添加中低添加量ADF(0～5%)時，混合凝膠的微觀結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生明顯變化，可能是添加量較少時ADF能較好地填充于蛋白網(wǎng)孔空隙中。但當添加高添加量ADF(10%～50%)時，隨著ADF添加量增大，混合凝膠體系網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸疏松、粗糙、孔隙變大，這可能是因為膳食纖維添加量過大，競爭性吸水溶脹，阻礙了肌原纖維蛋白的水化及蛋白之間的交聯(lián)[3]。這也就進一步解釋了高濃度ADF添加導(dǎo)致混合凝膠持水性下降和凝膠質(zhì)構(gòu)性能降低。

圖5 不同ADF添加量下混合凝膠微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Microstructure of heat induced MP gels with different contents of ADF

3 結(jié)束語

探究了ADF添加量對MP凝膠性能的影響。實驗結(jié)果表明：ADF與MP蛋白質(zhì)之間并無共價交聯(lián)行為；當添加量為1%～20%時，對混合溶膠體系的流變學(xué)特性無顯著影響，當添加量為50%時，其流變學(xué)特性遭到嚴重破壞；低ADF添加量(1%～5%)對混合凝膠的性能無負面影響，且添加5%時的混合凝膠蒸煮損失最小、綜合質(zhì)構(gòu)特性最好；高ADF添加量(10%～50%)時，過度競爭性吸水及溶脹抑制了MP的水化及交聯(lián)，導(dǎo)致混合凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)粗糙、空隙變大，蒸煮損失增大，硬度、彈性、咀嚼性和回復(fù)性等均降低。此外，由于ADF自身的顏色，其添加量增大會導(dǎo)致混合凝膠的白度下降。