郭樂薇 ,趙 靜 ,劉紅羽 ,王 軍* ,呂文發(fā)*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國際合作聯(lián)合重點實驗室，吉林長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室,吉林長春 130118）

卵巢作為雌性動物的重要繁殖器官，卵子生成和排卵以及性腺激素合成分泌均影響動物的繁殖性能[1-2]。卵泡是卵巢的基本功能單位[3]，每個卵泡均由顆粒細胞包圍一個卵母細胞組成。作為卵巢中必需的體細胞，顆粒細胞在機體內(nèi)環(huán)境下以增殖和凋亡的形式共同存在。顆粒細胞的增殖分化會促進卵泡發(fā)育、配子發(fā)生等生理過程[4-5]；而其凋亡是卵泡閉鎖的主要原因[6]。

MicroRNA（miRNA）是長度為20～25 個核苷酸的非編碼RNA，其通過靶向mRNA 3 ′UTR 內(nèi)的部分互補序列起作用，降解或抑制其翻譯。miRNA 通過調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡等多種細胞過程在生理和病理條件下發(fā)揮作用[7-8]。miRNA 參與卵巢卵泡發(fā)育的整個過程，包括卵泡生長、閉鎖和排卵[9]。miR-10 家族位于HOX基因簇內(nèi)，包括miR-10a 和miR-10b[10]。HOX 不僅可維持正常組織的增殖與分化過程，而且其突變會引起雌性生殖道和子宮發(fā)育異常，導(dǎo)致不孕[11]。miR-10 家族在早期胚胎發(fā)育期間與HOX 共表達[12]，推測miR-10b在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。魏金銷等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-10b 可抑制山羊卵巢顆粒細胞的活性。然而目前關(guān)于miR-10b 對牛卵巢顆粒細胞的影響尚不清楚。本研究旨在通過Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）、Western Blot 和流式細胞術(shù)探究miR-10b 對牛卵巢顆粒細胞凋亡的影響，為減少母畜卵泡資源浪費、提高母畜繁殖能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 DMEM/F12（Gibco，美國）；雙抗（生工生物工程有限公司，中國）LipofectamineTM2000（賽默飛世爾科技公司，中國）；miR-10b 模擬物（mimics）和mimic NC（蘇州吉瑪基因股份有限公司，中國）；總RNA 提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（TaKaRa，日本）；RIPA 裂解液、SDSPAGE 凝膠快速配制試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，中國）；Intercept?（PBS）Blocking Buffer（LI-COR，美國）；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（新賽美生物科技有限公司，中國）；細胞凋亡試劑盒（BD Pharmingen，美國）。

1.2 牛卵巢采集和卵巢顆粒細胞培養(yǎng) 本實驗所用卵巢均從屠宰場剛屠宰的母牛身上取出，新鮮卵巢組織浸潤在37℃含雙抗（鏈霉素和青霉素的混合液）的生理鹽水中，并在3 h 內(nèi)運回實驗室。手術(shù)剪剪去卵巢周圍多余組織，使用37℃含雙抗的生理鹽水沖洗2 次，75%酒精浸泡30 s，再用37℃含雙抗的生理鹽水沖洗3～5 次。移入無菌操作臺，使用5 mL 注射器抽吸3～6 mm 的健康卵泡。卵泡液經(jīng)1 000 r/min 離心5 min，細胞沉淀用37℃含雙抗的DMEM/F12 重懸細胞，重復(fù)2～3 次。細胞計數(shù)后以1×106～1.2×106的密度接種，轉(zhuǎn)移至37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，24 h 后棄細胞上清液，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并根據(jù)后續(xù)實驗需求，進行相應(yīng)處理。

1.3 牛卵巢顆粒細胞轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前1 d，將細胞接種至60 mm 板中（1×106個/孔），加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，保證其在第2 天細胞密度達到70%～90%。分別使用1 250 μL DMEM/F12稀釋500 pmol miR-10b mimics和mimics NC 并混勻，序列見表1。1 000 μL DMEM/F12稀釋20 μL LipofectamineTM2 000，混勻并室溫靜置5 min。將前兩步的預(yù)混液混合，室溫孵育20 min。用PBS 沖洗細胞3 次，每板加入混合液并加入DMEM/F12 補充至4.5 mL，輕晃混勻，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h 后每板加入500 μL 胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，提取RNA 和蛋白用于后續(xù)檢測。

表1 miR-10b mimics/NC 序列

1.4 RNA 提取和qRT-PCR TRIzol 法提取牛卵巢顆粒細胞總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于qRT-PCR 檢測。本實驗所需的引物由上海生工生物工程有限公司合成（表2）。qRT-PCR 反應(yīng)體系20 μL：2 μL cDNA 模板，10 μL SYBR Premix Ex Taq II，0.4 μL ROX reference Dye II，上游、下游引物各0.8 μL（0.4 μmol/L），6 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；40×（95℃ 5 s，56～64℃34 s）；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95°C 15 s。用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量，每個樣本進行3 次重復(fù)分析。

1.5 蛋白提取和Western Blot RIPA 裂解液提取牛卵巢顆粒細胞的總蛋白，根據(jù)BCA 說明書檢測處理樣品蛋白濃度。配制12%聚丙烯酰胺凝膠，上樣40 μg/孔。80 V 電壓電泳至分離膠，更換電壓為160 V，采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，0.12 A 28 min。使用Intercept?（PBS)Blocking Buffer 封閉1.5 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌5 min/5 次，二抗孵育1 h，TBST 洗滌5 min/5 次，隨后用ECL 發(fā)光液顯影,用Tanon Gis 軟件進行灰度值分析?？贵w信息見表3。

表2 qRT-PCR 引物序列

表3 Western Blot 抗體信息

1.6 流式細胞術(shù) 將處理好的細胞棄液，PBS 沖洗3遍，胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。再用PBS 重懸細胞1 000 r/min 離心5 min，重復(fù)2 次。根據(jù)細胞凋亡試劑盒要求，加入200 μL 1×Buffer，PI 和FITC 各5 μL，37℃培養(yǎng)箱孵育20 min，再加入100 μL 1×Buffer。過膜至流式管中，立即上機檢測。

1.7 統(tǒng)計分析 使用GraphPad prism 5.0 對數(shù)據(jù)進行t檢驗，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-10b 轉(zhuǎn)染驗證 qRT-PCR 檢測內(nèi)源miR-10b的表達，驗證miR-10b 的轉(zhuǎn)染效率。如圖1 所示，與mimics NC 組比較，miR-10b mimics 組中miR-10b 表達量極顯著升高，表明miR-10b mimics 轉(zhuǎn)染成功。

2.2 qRT-PCR 檢測凋亡相關(guān)基因 如圖2 所示，與mimics NC 組相比，miR-10b mimics 組Bax（P＜0.01）和Caspase-3（P＜0.05）mRNA 表達水平升高，Bcl-2mRNA 表達水平降低（P＜0.05）。表明miR-10b 可影響凋亡相關(guān)基因的表達，促進牛卵巢顆粒細胞凋亡。

2.3 Western Blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白 如圖3 所示，與mimics NC 組相比，miR-10b mimics 組Bax（P＜0.01）和Caspase-3（P＜0.05）蛋白表達水平升高，Bcl-2 蛋白表達水平顯著極降低。與qRT-PCR 結(jié)果一致，表明miR-10b 可影響凋亡相關(guān)蛋白的表達，促進牛卵巢顆粒細胞凋亡。

2.4 細胞凋亡水平檢測 如圖4 所示，與mimics NC 組相比，miR-10b mimics 組細胞凋亡率升高（P＜0.01）。

3 討論

在卵泡發(fā)育過程中，卵母細胞和周圍顆粒細胞之間的相互作用對于正常的卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟至關(guān)重要[14]。因此，卵巢顆粒細胞的凋亡會影響母畜的繁殖性能。miRNA 可調(diào)節(jié)許多細胞過程，如細胞增殖、凋亡和分化。近年來，越來越多的研究表明miRNA 在顆粒細胞功能的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。體內(nèi)卵巢氧化應(yīng)激模型中miR-181a 通過下調(diào)SIRT1 使FoxO1 乙?；M而促進鼠顆粒細胞凋亡，損害其卵泡發(fā)育；而敲除內(nèi)源性miR-181a 則阻止了H2O2誘導(dǎo)的顆粒細胞凋亡[15]。miR-1275 是在豬卵巢卵泡閉鎖過程中差異表達的miRNA 之一。研究發(fā)現(xiàn)miR-1275 可抑制雌二醇（E2）釋放和CYP19A1 的表達，以促進豬顆粒細胞的早期凋亡，引發(fā)豬卵巢卵泡閉鎖[16]。Wang 等[17]研究表明，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）參與卵泡生長，用miR-125a-5p mimics 轉(zhuǎn)染小鼠顆粒細胞觀察到STAT3 表達降低，Cleaved-caspase3 蛋白表達升高，顆粒細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)miR-10b 可促進牛卵巢顆粒細胞凋亡，影響凋亡相關(guān)因子表達。

miR-10 家族在不同物種之間高度保守。Tu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-10b 可通過抑制TGF-β途徑抑制人、小鼠和大鼠顆粒細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。CYP19A1 編碼芳香酶，是E2合成中的關(guān)鍵酶，在豬卵泡閉鎖過程中被下調(diào)。Li 等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-10b 可通過靶向CYP19A1 抑制E2釋放參與豬卵巢顆粒細胞凋亡。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）及其高親和力受體酪氨酸激酶受體B 被認為與雌性生殖有關(guān)。最近已證明在卵泡活化和卵母細胞成熟中起著重要作用。Peng 等[20]使用雙熒光素酶報告基因測定法將BDNF基因鑒定為miR-10b 的直接靶標，證明了miR-10b 可通過直接靶向BDNF 抑制山羊顆粒細胞增殖。然而，關(guān)于miR-10b 對牛卵巢顆粒細胞的作用尚不清楚。許多凋亡信號因子（Bax、Bcl-2 和Caspase-3等）在顆粒細胞中發(fā)揮作用。Bax 可通過破壞線粒體內(nèi)外膜完整性來對抗抗凋亡基因[21]，與健康卵泡相比，閉鎖卵泡顆粒細胞中Bax 的表達更高[22]。Bcl-2 可定位至線粒體內(nèi)外膜上發(fā)揮作用對抗凋亡[23]，Bcl-2 過表達可減少有腔卵泡的顆粒細胞凋亡，促進卵泡發(fā)生[24]。Caspase-3 是引起細胞凋亡的起始因子[25]，能夠誘導(dǎo)細胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的凋亡，Caspase-3基因敲除小鼠表現(xiàn)出顆粒細胞凋亡數(shù)量顯著降低[26]。本研究將miR-10b mimics 轉(zhuǎn)染牛卵巢顆粒細胞，發(fā)現(xiàn)miR-10b 可促進牛卵巢顆粒細胞的凋亡且伴隨著Bcl-2 mRNA 和蛋白表達降低，Bax 和Caspase-3 mRNA 和蛋白表達升高。本研究結(jié)果與以往報道一致，表明miR-10b 在不同物種中的顆粒細胞中具有相似的功能且高度保守。盡管本研究已證明miR-10b 可促進牛卵巢顆粒細胞凋亡，但其作用機制尚不清楚，需進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，miR-10b 可促進牛卵巢顆粒細胞凋亡，顯著降低Bcl-2 mRNA 和蛋白表達水平，顯著升高Bax、Caspase-3 mRNA 和蛋白表達水平。