何林楓 蔡麗莎 楊寬 曾珍 李誠

摘要：為了研究牦牛曲拉干酪素的結構及功能性質(zhì)，以牦牛曲拉為原料，將胃蛋白酶、木瓜凝乳酶、酵母凝乳酶復配成復合凝乳酶，用混合凝乳酶制備牦牛曲拉干酪素，對牦牛曲拉干酪素的基本成分、氨基酸組成、蛋白質(zhì)組成、紅外光譜特性、圓二光譜特性、變性溫度等進行分析，并模擬食品加工體系中的不同溫度、pH值，觀察其對牦牛曲拉干酪素功能性質(zhì)的影響。結果表明，牦牛曲拉干酪素中谷氨酸含量最高，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的42%;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）測定結果表明，牦牛曲拉干酪素蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量主要分布在25 000～37 000。用紅外光譜分析檢測得到-NH、C=O等特征官能團，用圓二色光譜鑒定得出，牦牛曲拉干酪素是無規(guī)則卷曲型蛋白質(zhì)，其中α-螺旋占11.3%，β-折疊占26.8%，β-轉(zhuǎn)角占23.3%，無規(guī)則卷曲占38.6%。研究結果還表明，牦牛曲拉干酪素的熱穩(wěn)定性較高，變性溫度達到123 ℃左右。牦牛曲拉干酪素的主要功能特性如下：當溫度接近50 ℃時，具有優(yōu)良的溶解性、乳化性、發(fā)泡穩(wěn)定性;在較高溫度（50～70 ℃）下，持油性、發(fā)泡能力明顯增強;在pH值為3～11條件下，除等電點（pH值=4.6）外，有較優(yōu)良的功能特性;在中性條件下，干酪素溶液的表觀黏度最大，最小凝膠含量最低。

關鍵詞：牦牛;曲拉;干酪素;結構性質(zhì);功能性質(zhì)

中圖分類號：TS252.53文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）03-0709-11

Structural and functional properties of casein made from yak Qula

HE Lin-feng，CAI Li-sha，YANG Kuan，ZENG Zhen，LI Cheng

（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Yaan 625014， China）

Abstract：To characterize the structural and functional properties of casein made from yak Qula by complex rennin containing pepsin， chymopapain and yeast rennin， the basic components， amino acid composition， protein composition， infrared spectroscopy， circular dichroism and denaturation temperature of the casein were studied. Different temperatures and pH values in food processing system were simulated to observe the effects on functional characteristics of casein made from yak Qula. The results showed that the content of glutamic acid was highest in casein， and the content ratio of essential amino acids to total amino acids was 42%. The results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） indicated that the relative molecular weight of casein protein in yak gula mainly ranged from 25 000 to 37 000. The functional groups such as carbonyl and imino groups were detected by infrared spectrum analysis. The results of circular dichroism chromatography showed that casein was a kind of random coil protein， and it was found that the α-helix accounted for 11.3%， the β-fold accounted for 26.8%， the β-corner accounted for 23.3%， and the random coil accounted for 38.6%. In addition， casein showed high thermal stability with the denaturation temperature of 123 ℃. The main functional characteristics of casein made from yak Qula are as follows： the casein has excellent solubility， emulsification and foaming stability when the system temperature is close to 50 ℃; the oil-holding and foaming capacity of casein are significantly enhanced at relatively higher temperature（50-70 ℃）; when the pH value was 3.0-11.0， except for the isoelectric point（pH=4.6）， the casein has excellent functional properties; the rheological properties are optimal under neutral condition.

Key words：yak; Qula; casein; structural properties; functional properties

牦牛是在貧瘠的高原地區(qū)經(jīng)過長期自然選擇和適應后形成的一種特殊牛種，其分泌的乳汁中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等，且含量顯著高于其他牛種，這些營養(yǎng)成分對人體的生理活動都有非常重要的作用[1]。在牦牛乳中，酪蛋白含量高達34.28～45.79 g/L，約為普通牛乳的1.5倍，因而牦牛乳可作為優(yōu)良的乳源應用到乳品加工中[2]。中國的牦牛主要生長在西藏、青海、新疆、四川、甘肅和云南6個?。▍^(qū)），數(shù)量達到了世界總數(shù)的94%。中國西部人民（本研究中主要指藏族）僅提煉牦牛乳的脂肪部分進行食用，而將脫脂牦牛乳在自然條件下經(jīng)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸后凝固、結塊、風干得到的產(chǎn)品曲拉并未被充分利用[3-4]，造成大量優(yōu)質(zhì)動物蛋白質(zhì)資源的浪費。干酪素又名酪蛋白，是一種性能獨特的天然蛋白質(zhì)基礎原料，在國外主要以鮮乳為原料生產(chǎn)得到[5]，而國內(nèi)由于乳資源匱乏、成本高昂且在運輸過程中容易造成鮮乳腐敗變質(zhì)，因此目前干酪素產(chǎn)業(yè)發(fā)展較慢，基本沒有形成市場化[6]。以牦牛曲拉為原料，經(jīng)堿溶脫脂、凝乳沉淀、干燥粉碎等工序，即可得到牦牛曲拉干酪素[7]。干酪素可以作為食品添加劑或品質(zhì)改良劑廣泛應用于食品、醫(yī)藥、輕工等領域。國外相關報道顯示，干酪素的功能特性可以通過物理、化學手段得到提升[8]，從而為進一步開發(fā)新型功能性干酪素提供了思路。目前，國內(nèi)外關于牦牛的研究主要集中在牦牛群落、牦牛奶中細菌多樣性方面，其副產(chǎn)品的開發(fā)和利用尚未見系統(tǒng)報道[9]。

本研究以牦牛曲拉干酪素為研究對象，對干酪素進行產(chǎn)品品質(zhì)分析，包括基本成分測定、氨基酸組成測定、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）分析、紅外光譜分析、圓二色光譜（Circular dichroism， CD）分析、熱力學性質(zhì)分析等，并模擬食品加工中的不同酸堿度、加熱溫度等條件，探索其對牦牛曲拉干酪素功能性質(zhì)的影響，以期為用復合酶制備的牦牛曲拉干酪素在食品工業(yè)中的應用提供一定參考，從而擴大曲拉干酪素的應用范圍，增加牦牛產(chǎn)業(yè)的附加值。

1材料與方法

1.1材料與試劑

曲拉，購自四川甘孜藏族自治州瀘定縣;小牛皺胃酶（酶活性≥20 000 U/g），購自美國Sigma-Aldrich科技公司;胃蛋白酶（酶活性≥800 000 U/g），購自上海瑞永生物科技有限公司;木瓜凝乳酶（酶活性≥20 000 U/g），購自廣西龐博生物工程有限公司;酵母凝乳酶（酶活性≥60 000 U/g），購自DSM有限公司。

SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、蛋白marker，購自美國Bio-Rad公司;NaOH、HCl、KBr、石油醚、乙醚，購自成都市科隆化學品有限公司;濃鹽酸為優(yōu)級純，購自上海源葉生物科技有限公司;玉米油、大豆油，購自中糧國際（北京）有限公司四川分公司;試驗用水為超純水，由筆者所在實驗室自制。

1.2儀器與設備

KDN-1全自動凱氏定氮儀，購自上海儀田精密儀器有限公司;Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、Bio-Rad Powerpac Basic電泳儀，購自美國Bio-Rad公司;S433D全自動氨基酸分析儀，購自德國Sykam公司;NicoletIS10傅里葉變換紅外光譜儀，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;Chirascan-plus圓二色光譜儀，購自英國應用光物理公司;Q200MDSC差示掃描量熱儀、DHR-1旋轉(zhuǎn)流變儀，購自美國TA儀器[沃特世科技（上海）有限公司];RCD-1A高速均質(zhì)乳化機，購自常州越新儀器制造有限公司;MICROMAX高速離心機，購自美國Thermo公司;V-1200可見分光光度計，購自上海美譜達儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1牦牛曲拉干酪素的制備工藝流程：原料粉碎→堿液溶解→過濾→離心分離→巴氏殺菌→冷卻→凝乳→洗滌→烘干→成品。

牦牛曲拉經(jīng)42 ℃鼓風干燥后粉碎過篩，按照1∶11（g∶ml）的料液比加入蒸餾水后，緩緩滴加質(zhì)量分數(shù)為16%的氫氧化鈉溶液，于65 ℃水浴鍋中攪拌溶解30 min，溶解后用100目濾布過濾除雜，于4 000 r/min離心20 min，倒出上清液，先用鹽酸調(diào)節(jié)上清液的pH值至6.3，再添加1%復合酶（酶胃蛋白酶、木瓜凝乳酶、酵母凝乳酶的質(zhì)量比為0.60∶0.18∶0.22），在復合酶添加量為1%、溫度為45 ℃、凝乳時間為30 min、CaCl2添加量為1%（質(zhì)量分數(shù)）的條件下凝乳，將所得凝乳水洗、脫水、造粒、干燥后備用[10]。

1.3.2牦牛曲拉干酪素基本成分的測定水分含量的測定參照GB5009.3-2016《食品中水分的測定》;脂肪含量的測定參照GB/T 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》;蛋白質(zhì)含量的測定參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》。

1.3.3牦牛曲拉干酪素中氨基酸組成的測定牦牛曲拉干酪素中氨基酸組成的測定參照GB5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》，采用氨基酸自動分析儀進行測定;色氨酸含量的測定參照GB/T 15400-2018《飼料中色氨酸的測定》，采用分光光度法進行測定。

1.3.4十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析SDS-PAGE分析參考管方方等[11-12]的報道，并稍作改動。電泳樣品的制備過程：稱取0.2 g牦牛曲拉干酪素粉末于具塞三角瓶中，加入20 ml濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液，水浴煮沸溶解，然后用0.1 mol/L樣品緩沖液定容到100 ml。將制備好的樣品和上樣緩沖液混合，按照樣品、緩沖液體積比為1∶1的比例配制成1 ml溶液后搖勻，用沸水浴加熱5 min制得電泳樣，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

SDS-PAGE分析所用12%分離膠和4%濃縮膠的配制方法參照試劑盒說明書。電泳條件：5 μl Marker上樣量，10 μl樣品上樣量，保持150 V恒壓至蛋白質(zhì)染液進入分離膠，保持120 V恒壓至蛋白質(zhì)染液停在分離膠底部，關閉電源。電泳結束后，依次對電泳膠片進行固定、染色、脫色，然后用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進行拍照分析。

1.3.5傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析將2.0 mg牦牛曲拉干酪素粉末與預先干燥的0.2 g溴化鉀混合研磨后壓片，用NicoletIS10型傅里葉變換紅外光譜儀測定紅外光譜，掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次。

1.3.6圓二色光譜分析參考孔繁華等[13]的方法，用Chirascan-plus型圓二色光譜儀測定光譜，配制濃度為0.5 mg/ml的樣品溶液，記錄的光譜數(shù)據(jù)是3次樣品掃描光譜數(shù)據(jù)各自減去緩沖光譜數(shù)據(jù)的平均值。測定參數(shù)如下：掃描波長為190～250 nm，掃描速率為100 nm/min，比色皿光徑為1 mm，數(shù)據(jù)間隔為1.0 nm，帶寬為2.0 nm，掃描次數(shù)為3次。

1.3.7差示掃描量熱法（Differential scanning calorimetry，DSC）分析參考Wee等[14]的方法，對牦牛曲拉干酪素進行熱變性分析。取10.0 mg樣品于坩堝中密封，以空坩堝作為空白對照，置于Q200MDSC型差示掃描量熱儀中，在溫度為20～190 ℃、氮氣流速為50 ml/min的條件下記錄其熱力學曲線。

1.3.8牦牛曲拉干酪素的功能性質(zhì)分析參考胡濤等[15]的方法，將牦牛曲拉干酪素配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml的溶液，在室溫下低速攪拌3 h。分別移取100 ml 1.0 mg/ml牦牛曲拉干酪素溶液，在2 min內(nèi)用濃度為1.0 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值至3～11，分別置于不同溫度（40～80 ℃）的水浴中加熱30 min，得到用不同條件處理的待測溶液。

1.3.8.1溶解性的測定參考Du等[16]的方法，將待測溶液分別離心（20 min、3 500 r/min），并在280 nm波長下測定上清液中的蛋白質(zhì)含量，按照式（1）計算其溶解度：

溶解度=上清液中蛋白質(zhì)含量總蛋白質(zhì)含量×100%（1）

1.3.8.2乳化性的測定（1）乳化活力指數(shù)（Emulsifying activity index， EAI）及乳化穩(wěn)定性（Emulsion stability， ES）的測定。參照Jiang等[17]的方法，分別取6 ml待測溶液加入離心管中，再加入2 ml玉米油，用高速均質(zhì)機于20 000 r/min分散1 min，獲得乳濁液，取50 μl乳濁液，加入5 ml質(zhì)量濃度為0.1 g/L的SDS溶液，用渦旋混合儀混合5 s后，在500 nm處測定吸光度，記為A0;將乳濁液靜置10 min后，再次測定吸光度，記為A10。EAI（m2/g）、ES（%）分別根據(jù)式（2）、式（3）進行計算：

式中，C為樣品溶液的質(zhì)量濃度（g/ml），θ為乳液中油相的體積比率，本研究中取0.25，A0為乳液靜置0 s時的吸光度，A10為乳液靜置10 min時的吸光度。

（2）乳化能力（Emulsion capacity， EC）的測定。參考Mir等[18]的方法測定牦牛曲拉干酪素的乳化能力。分別取20 ml待測溶液加入容量為250 ml的不同燒杯中，再分別加入20 ml玉米油，用高速均質(zhì)機分散2 min后，將分散液轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，于4 000 r/min離心10 min，立刻測量油層體積V0 （ml）。EC的計算公式如下：

1.3.8.3發(fā)泡性能的測定參考Lonchamp等[19]的方法并稍作修改，對牦牛曲拉干酪素樣品的發(fā)泡性能進行評價。分別取20 ml待測溶液置于250 ml燒杯中，選用刀片式攪拌機，于20 000 r/min攪拌1 min，立即讀出泡沫體積V1（ml），靜置30 min后再次測量泡沫體積V2（ml），其發(fā)泡性（Foaming capability， FC）及發(fā)泡穩(wěn)定性（Foaming stability， FS）分別按照式（5）、式（6）計算：

式中，V1為0 min時泡沫總體積，V2為30 min時泡沫總體積。

1.3.8.4持油性的測定參考Vioque等[20]的方法，稱取質(zhì)量為m0（0.5 g左右）的牦牛曲拉干酪素于離心管內(nèi)，記錄離心管和樣品的質(zhì)量為m1，接著加入少量大豆油，在渦旋混合儀上混合1 min后，再加入少許大豆油進行混合。分別在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃水浴鍋中反應30 min，冷卻后于4 000 r/min離心20 min，棄去上層油，稱取離心管和樣品質(zhì)量，記為m2。若沒有出現(xiàn)油狀物，則繼續(xù)加油攪拌離心，直至出現(xiàn)少量大豆油為止。持油性按照式（7）計算：

持油性=m2-m1m0×100%（7）

1.3.8.5流變特性的測定（1）黏度的測定。將待測溶液分別置于燒杯中，在室溫下用DHR-1型旋轉(zhuǎn)流變儀進行牦牛曲拉干酪素溶液黏度的測定，采用“peak hold”模式，剪切速率為300 s -1，數(shù)據(jù)采集時間為120 s，錐板直徑為40 mm，記錄牦牛曲拉干酪素溶液在剪切速率為300 s-1時的表觀黏度曲線。

（2）最小凝膠含量的測定。參照Mundi等[21]的方法并略作修改，測定牦牛曲拉干酪素的最小凝膠含量。稱取不同質(zhì)量的牦牛曲拉干酪素并分別溶于100 ml磷酸緩沖液中，配制成不同含量（10%～25%）的溶液，并用1.0 mol/L HCl或1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。取5 ml溶液，在100 ℃水浴鍋中反應1 h后用流動水使之冷卻，并儲存在4 ℃冰箱中過夜，使凝膠成形。牦牛曲拉干酪素的最小凝膠含量可以定義為把樣品旋轉(zhuǎn)后所形成的凝膠沒有滑落或掉落時的最小樣品含量。

1.3.9數(shù)據(jù)分析所有試驗數(shù)據(jù)均為3次重復的結果，用Origin 9.1軟件進行作圖分析。

2結果與分析

2.1牦牛曲拉干酪素的基本成分

由表1可知，本試驗制備的牦牛曲拉干酪素產(chǎn)品基本成分（脂肪、水分、蛋白質(zhì)、酪蛋白）含量符合GB31638-2016《食品安全國家標準酪蛋白》的要求，表明該牦牛曲拉干酪素產(chǎn)品的質(zhì)量較好，具有開發(fā)利用價值。

2.2牦牛曲拉干酪素的氨基酸組成

蛋白質(zhì)的基本組成是氨基酸，因而蛋白質(zhì)的品質(zhì)在很大程度上取決于氨基酸的組成[22]。由表2可知，牦牛曲拉干酪素產(chǎn)品中的總氨基酸質(zhì)量分數(shù)為83.44%，其中谷氨酸質(zhì)量分數(shù)高達16.09%，總氨基酸中必需氨基酸占42.00%，可見氨基酸組成合理，必需氨基酸含量豐富。由于牦牛曲拉干酪素有較平衡的氨基酸組成，因此可以作為蛋白質(zhì)類營養(yǎng)強化劑應用在食品工業(yè)中。

人體必需氨基酸用*標注，其中組氨酸（His）為嬰兒必需氨基酸。

2.3牦牛曲拉干酪素的蛋白質(zhì)組分

用SDS-PAGE分離出的譜帶均為蛋白質(zhì)的亞基譜帶，如圖1中的泳道2所示，在25 000～37 000相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)，電泳條帶較深，說明檢測產(chǎn)品的主成分為25 000～37 000大小的蛋白質(zhì)，分別是α-酪蛋白、β-酪蛋白;在15 000～20 000相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)出現(xiàn)了顏色較淺的條帶，分別是為κ-酪蛋白、γ-酪蛋白。α-酪蛋白、β-酪蛋白這個2個組分沒有完全被分開的原因可能是由于該牦牛曲拉干酪素產(chǎn)品是經(jīng)凝乳酶凝乳形成的，酪蛋白組分之間通過疏水鍵形成三維網(wǎng)狀結構，并通過凝乳過程中加入的Ca2+的架橋作用形成凝乳，蛋白質(zhì)組分之間存在交聯(lián)作用，所以不能完全被分離[23]。李曉暉[24]研究酪蛋白分子的主要亞基組成發(fā)現(xiàn)，其主要成分為α-酪蛋白（含量約為75%）、β-酪蛋白（含量約為22%），其中α-酪蛋白的相對分子質(zhì)量約為27 000，β-酪蛋白的相對分子質(zhì)量約為24 000;其次為κ-酪蛋白、γ-酪蛋白（二者總含量約為3%）。此外，在該產(chǎn)品中未檢測到明顯的低相對分子質(zhì)量（<14 000）蛋白質(zhì)條帶，說明該產(chǎn)品在制備過程中沒有發(fā)生明顯的水解作用，蛋白質(zhì)沒有被破壞，得到的產(chǎn)品純度較高。

2.4牦牛曲拉干酪素的紅外光譜分析

用傅里葉變換紅外光譜儀對牦牛曲拉干酪素進行官能團檢測分析。由圖2可知，牦牛曲拉干酪素在3 649 cm-1附近有N-H的伸縮振動吸收峰;在2 963 cm-1附近有C-H的飽和振動吸收峰;在1 500～1 700 cm-1處為酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的吸收譜區(qū);在1 654 cm-1處的吸收峰是蛋白質(zhì)R-CO-NH2中C=O的伸縮振動引起的典型吸收峰，其吸收峰強，表明此區(qū)域是酪蛋白分子二級結構發(fā)生變化的敏感區(qū)域;在1 536 cm-1附近有C-H彎曲振動吸收峰、C-N伸縮振動吸收峰，主要是由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲效應相互疊加而出現(xiàn)的;在1 200～1 400 cm-1附近有酪蛋白分子酰胺Ⅲ帶的特征吸收譜區(qū)，其吸收峰位于1 232 cm-1位置，符合酪蛋白的特征吸收規(guī)律。

2.5牦牛曲拉干酪素的圓二色光譜分析

遠紫外（190～250 nm）CD常用來反映肽鍵的圓二色性，不同蛋白質(zhì)所具有的二級結構或多肽所產(chǎn)生譜帶的信息、吸收強弱均不同，由此可以反映蛋白質(zhì)或多肽鏈的結構信息。由圖3可知，牦牛曲拉干酪素的圓二色光譜曲線在195 nm附近形成1個負峰，在222 nm附近有1個不明顯的肩峰，說明本酪蛋白膠束中的α-螺旋含量很低，屬于無規(guī)則卷曲型蛋白質(zhì)。許銘珠[25]在研究酪蛋白時也提出，酪蛋白是一種典型的無規(guī)則卷曲型蛋白質(zhì)，與本研究結果一致。由CD-Pro軟件計算結果可知，牦牛曲拉干酪素中的α-螺旋占11.3%，β-折疊占26.8%，β-轉(zhuǎn)角占23.3%，無規(guī)則卷曲占38.6%，其中無規(guī)則卷曲比例最高，α-螺旋比例最低。

2.6牦牛曲拉干酪素的熱變性

由于加熱能夠使蛋白質(zhì)的結構發(fā)生變化而導致其功能受到影響，因此研究食品中蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性對于蛋白質(zhì)的合理利用具有重要意義。蛋白質(zhì)在加熱過程中由于吸收了熱量，分子會由有序狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序狀態(tài)，多肽鏈因此展開，當達到蛋白質(zhì)變性溫度時，在熱分析圖譜上就會出現(xiàn)1個吸熱峰，該峰值對應的溫度即為該蛋白質(zhì)的熱變性溫度，由峰面積便可以確定該蛋白質(zhì)的變性熱焓[26]。采用差示掃描量熱儀對本研究中制備的牦牛曲拉干酪素進行熱力學分析。從圖4可以看出，牦牛曲拉干酪素熱分析曲線在123 ℃附近出現(xiàn)1個主要的吸熱峰，該溫度可能是酪蛋白的變性溫度，變性熱焓值較大，為165.1 J/g，表明被測樣品中未變性蛋白質(zhì)的含量較高。由于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)變性溫度的高低密切相關，變性溫度越高，表明蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性越好。因此可見，該干酪素具有較好的熱穩(wěn)定性，可以應用到食品加工業(yè)中。

2.7牦牛曲拉干酪素的功能性質(zhì)

2.7.1溶解性蛋白質(zhì)的溶解度是重要的理化特性，常與其他功能特性如發(fā)泡能力和乳化特性相關[27]。由圖5可以看出，在恒定的pH值條件下，當溫度從40 ℃上升到60 ℃時，牦牛曲拉干酪素的溶解度整體上逐漸提高;當溫度超過60 ℃時，牦牛曲拉干酪素的溶解度下降。隨著溫度的上升，會使蛋白質(zhì)分子在水溶液中的構象展開，當分子內(nèi)部親水基團逐漸暴露時，蛋白質(zhì)的溶解度就會提高。但是溫度過高時，基團暴露得過多，基團間的相互作用會破壞肽鍵結構，蛋白質(zhì)會因此發(fā)生聚集和沉淀，從而使溶解度下降。Chen等[28]通過研究溫度對脫脂乳粉蛋白質(zhì)溶解度的影響也得出了類似的結論。此外，由圖5還可以看出，牦牛曲拉干酪素的溶解度與pH值之間呈現(xiàn)“V”形關系：當pH值接近等電點（pH值=4.6）時，牦牛曲拉干酪素有最低的溶解度，可能由于此時正負電荷的平衡降低了蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力，從而使得牦牛曲拉酪蛋白開始沉淀;當pH值遠離等電點（pH值<4或>7）時，由于蛋白質(zhì)所帶的電荷增多，分子之間的靜電斥力增大，從而使得牦牛曲拉干酪素的溶解度增加。Chee等[29]和Maria等[30]分別以大豆蛋白質(zhì)和脫脂腰果殼中分離的蛋白質(zhì)為原料，研究蛋白質(zhì)溶解度與pH值之間的關系，其研究結果與本試驗得出的結果類似。本研究所得牦牛曲拉干酪素的溶解特性與多種蛋白質(zhì)類似。

2.7.2乳化性本研究測定了牦牛曲拉干酪素的乳化活力指數(shù)、乳化穩(wěn)定性和乳化能力等乳化性指標。

由圖6可知，在低溫（40 ℃、50 ℃）下，隨著溫度升高，牦牛曲拉干酪素的EAI值基本不變;當溫度在50 ℃以上且遠離等電點時，牦牛曲拉干酪素的EAI值變化較大，表現(xiàn)出隨著溫度的上升而急劇降低的趨勢。可能是由于溫度升高時，蛋白質(zhì)的結構逐漸被破壞，從而導致乳化活性下降。由圖7可知，隨著溫度的升高，牦牛曲拉干酪素的ES值整體上逐漸降低，但是降低幅度比EAI值低。Britten等[31]通過研究熱處理對熱變性乳清蛋白和天然乳清蛋白混合物EAI、ES值的影響，也得出了同樣的結論。由圖8可知，當溫度達到80 ℃時，EC值極低，與較高溫度對牦牛曲拉干酪素溶解性的影響類似，可能由于低溫處理會提高蛋白質(zhì)分子的柔性和親水性，從而使得此時的乳化性較好。然而當溫度過高時，蛋白質(zhì)發(fā)生聚沉，能夠參與到乳化作用中的有效分子減少，形成的蛋白質(zhì)乳狀液易黏結而分層。

此外，蛋白質(zhì)的乳化性、乳化穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)親水、親油基團的表面分布及分子柔性有關，不同的pH值會影響蛋白質(zhì)疏水基團、親水基團和表面電荷的分布和變化。由圖7、圖8可知，牦牛曲拉干酪素的乳化穩(wěn)定性和乳化能力在等電點附近（pH值=4.6）最低，可能由于此時的溶解度最小，能夠參與乳化的可溶性蛋白質(zhì)較少;而在遠離等電點（pH值<4或pH值>7）條件下，牦牛曲拉干酪素的乳化能力明顯提高，在偏酸性（pH值=3）條件下，牦牛曲拉干酪素整體上具有最強的乳化穩(wěn)定性。Zhao等[32]、Malomo等[33]分別通過研究pH值對花生蛋白質(zhì)制品、大麻籽蛋白質(zhì)粉乳化特性的影響也得出了類似結論?？梢姡鶕?jù)不同需要適當調(diào)節(jié)酸堿度可提高牦牛曲拉干酪素的乳化能力和乳化穩(wěn)定性。

2.7.3發(fā)泡性蛋白質(zhì)的發(fā)泡能力受到蛋白質(zhì)分子的擴散速率、界面張力大小、疏水基團的分布等因素影響，泡沫的穩(wěn)定性則主要取決于蛋白質(zhì)溶液的流變性質(zhì)。由圖9可知，牦牛曲拉干酪素溶液的發(fā)泡能力大致隨著溫度的上升而增大，原因可能是聚合的酪蛋白膠束通過降低界面張力，促進了泡沫膜的形成，從而提升了發(fā)泡性能;當溫度升高到70 ℃后，發(fā)泡能力的整體變化不大。由圖10可知，當溫度為50 ℃時，牦牛曲拉干酪素溶液所形成泡沫的穩(wěn)定性較高，可能由于此時溶液中的可溶性蛋白質(zhì)含量較其他溫度下有所增加，而可溶性蛋白質(zhì)在混合體系中的乳化能力明顯優(yōu)于不溶性蛋白質(zhì);隨著溫度增加至50 ℃以上，泡沫穩(wěn)定性下降的原因是熱處理使其黏度增加，蛋白質(zhì)分子間發(fā)生相互作用，從而導致泡沫不穩(wěn)定。

由圖9還可以看出，牦牛曲拉干酪素的發(fā)泡能力在等電點附近（pH值為4.6）最低，可能由于在等電點處酪蛋白發(fā)生沉淀，在聚合狀態(tài)下擴散較慢，從而使得發(fā)泡性降低;當pH值為6時，發(fā)泡能力有下降的趨勢，可能由于在此pH值條件下，牦牛曲拉干酪素的膠凝作用較明顯，從而使得發(fā)泡性較低;當遠離等電點（pH值<3或pH值>7）時，牦牛曲拉干酪素的發(fā)泡能力較好。Snchez等[34]研究蛋白質(zhì)和納米顆粒得到的結果也表明，由于pH值增加，界面壓力、界面膨脹特性提高，蛋白質(zhì)的發(fā)泡能力會提高。此外，在等電點附近（pH值為4.6）時，泡沫的穩(wěn)定性較高（圖10），可能由于此時界面上存在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，會使體系表面形成黏稠的膜;而遠離等電點時，泡沫的穩(wěn)定性會降低。結合牦牛曲拉干酪素的乳化特性可知，在高pH值和高乳化穩(wěn)定性下的牦牛曲拉干酪素有較高的發(fā)泡能力，Delgado等[35]在研究pH值對棉籽粕蛋白質(zhì)功能特性的影響時也得到了同樣的結論。

2.7.4持油性蛋白質(zhì)的持油性是指蛋白質(zhì)與游離油脂相結合的能力，在食品加工過程中能將油脂等風味物質(zhì)截留在食物中[33]。由圖11可知，在30～70 ℃，隨著溫度升高，牦牛曲拉干酪素的持油性在逐漸上升，可能由于蛋白質(zhì)經(jīng)過適當加熱后，分子會逐漸發(fā)生解離，使得肽鏈伸展，此時蛋白質(zhì)容易與油脂小分子結合，同時此溫度下油脂的流動性較低，容易被蛋白質(zhì)分子截留。隨著溫度上升到70 ℃，牦牛曲拉干酪素的持油性達到最大值，若繼續(xù)升溫，持油性則明顯下降。任秀艷等[36]在研究加熱對玉米胚芽粕蛋白質(zhì)持油性的影響時也得到類似結論。此外，趙小龍等[37]研究指出，溫度過高時，油脂的流動性明顯加強，整個混合體系的黏度下降，會嚴重影響蛋白質(zhì)的持油性。酪蛋白在70 ℃左右具有良好的持油性，可以作為一種潛在的功能性原料應用到模擬干酪和乳液型食物等高脂肪含量的產(chǎn)品中。

2.7.5牦牛曲拉干酪素的流變特性（1）黏性。蛋白質(zhì)流體的黏度主要由蛋白質(zhì)粒子的水合半徑（也稱為流體力學半徑）決定。經(jīng)過不同溫度和酸堿度處理后，牦牛曲拉干酪素的黏度變化如圖12所示?？梢钥闯觯笈Ｇ衫宜厝芤旱谋碛^黏度整體上隨著溫度的上升而逐漸減小，80 ℃時的黏度最低。酪蛋白分子是一種典型的無規(guī)則卷曲型蛋白質(zhì)，它在分散溶液中是以伸展開的無規(guī)則團狀結構形式存在的，它暴露出的親水基團會與水分子形成氫鍵。隨著體系溫度的升高，氫鍵被破壞，蛋白質(zhì)分子會經(jīng)歷從無規(guī)則線團狀到無規(guī)則線團卷曲狀的變化，此時的蛋白質(zhì)分子流體力學體積變小，黏度減小。此外，分子熱運動受到溫度的影響較大，高溫會減小體系的流動阻力，體系的剪切黏度也會隨之下降。

由圖12還可以看出，當pH值為7時，表觀黏度較大，可能是由于中性環(huán)境中的靜電斥力較弱，分子間的結合緊密，而當溶液偏堿（pH值>7）時，蛋白質(zhì)電荷會大量暴露，部分溫度下溶液的表觀黏度呈現(xiàn)下降趨勢。De Almeida等[38]在研究pH值對蛋白質(zhì)流變特性的影響時也得出類似的結論。可見，當牦牛曲拉干酪素作為食品原料或食品添加劑時，可以通過控制溶液的酸堿度、溫度來控制黏度。

（2）最小凝膠含量。蛋白質(zhì)的最小凝膠含量可以用來表征蛋白質(zhì)的成膠能力。如表3所示，在酸堿度為中性條件下，牦牛曲拉干酪素的最小凝膠含量最低，為12%±0.15%，可能是由于此時的正負電荷平衡降低了蛋白質(zhì)之間的斥力，從而增強了蛋白質(zhì)凝膠的形成能力，該結果與Tan等[39]研究得到的大豆蛋白質(zhì)在中性條件下的最小凝膠含量（12%）接近，說明酪蛋白與大豆蛋白質(zhì)有相似的熱穩(wěn)定性。在偏堿性（pH值>9）條件下，牦牛曲拉干酪素的最小凝膠含量較高，可能由于蛋白質(zhì)在堿性條件下溶解性較好，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用增強，從而減弱了蛋白質(zhì)凝膠的形成能力。

3結論

本研究用復合酶制備得到牦牛曲拉干酪素，該干酪素的蛋白質(zhì)含量為86.64%±1.09%，其中酪蛋白含量占總蛋白含量的96.72%±1.14%，蛋白質(zhì)亞基的相對分子質(zhì)量主要分布在25 000～37 000，變性溫度達到123 ℃左右。在牦牛曲拉干酪素的二級結構中，α-螺旋占11.3%，β-折疊占26.8%，β-轉(zhuǎn)角占23.3%，無規(guī)則卷曲占38.6%。紅外光譜分析結果顯示，牦牛曲拉干酪素具有-NH、C=O等特征官能團，表明該干酪素產(chǎn)品的純度較高，品質(zhì)較好，熱穩(wěn)定性較高，保留了天然酪蛋白的膠束結構，為進一步將其應用在食品加工領域、拓寬其應用范圍奠定了基礎。

通過對不同溫度、酸堿度條件下牦牛曲拉干酪素產(chǎn)品的功能特性研究發(fā)現(xiàn)，當溫度為50 ℃時，牦牛曲拉干酪素的溶解度較高，乳化穩(wěn)定性及發(fā)泡穩(wěn)定性較好;當溫度為70 ℃時，牦牛曲拉干酪素的持油性最佳，發(fā)泡能力增強。在等電點附近時，牦牛曲拉干酪素的發(fā)泡穩(wěn)定性最高;遠離等電點時，牦牛曲拉干酪素的溶解度、乳化性能、發(fā)泡性能較好，特別是在中性條件下，牦牛曲拉干酪素的表觀黏度較大，最小凝膠含量最低。因此可見，在食品加工生產(chǎn)中，可以通過改變酸堿度、加熱溫度等條件來獲得具有良好加工性質(zhì)的牦牛曲拉干酪素，從而充分利用牦牛曲拉資源，發(fā)展牧區(qū)經(jīng)濟，增加牧民收入，最終實現(xiàn)良好的經(jīng)濟效益。

參考文獻：

[1]LI H L， YANG C， CHEN C， et al. The use of trisodium citrate to improve the textural properties of acid-induced， transglutaminase-treated micellar casein gels[J]. Molecules， 2018， 23（7）： 1632.

[2]EI-BAKRY M， DUGGAN E， ORIORDAN E D， et a1. Effect of chelating salt type on casein hydration and fat emulsification during manufacture and post-manufacture functionality of imitation cheese[J]. Journal of Food Engineering， 2011， 102（2）： 145-153.

[3]王耀杰. 牦牛乳酪蛋白膠束理化性質(zhì)的研究[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2013.

[4]MOSCHOPOULOU E. Characteristics of rennet and other enzymes from small ruminants used in cheese production[J]. Small Ruminant Research， 2011， 101（1/2/3）： 188-195.

[5]王琳琳，韓玲，敏文祥，等. 干酪素加工工藝研究進展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2016，42（5）：277-282.

[6]李鳳林，蘭文峰. 乳與乳制品加工技術[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社，2010： 240-243.

[7]HOLT C， CARVER J A， ECROYD H， et al. Invited review： caseins and the casein micelle： their biological functions， structures， and behavior in foods[J]. Journal of Dairy Science， 2013， 96（10）： 6127-6146.

[8]CARTER B， PATEL H， BARBANO D M， et al. The effect of spray drying on the difference in flavor and functional properties of liquid and dried whey proteins， milk proteins， and micellar casein concentrates[J]. Journal of Dairy Science， 2018， 101（5）：3900-3909.

[9]YAN Z， YINGYING C， MIN Y， et al. Bacterial diversity and community in Qula from the Qinghai-Tibetan Plateau in China[J]. Peer J， 2018， 6： 6044.

[10]何林楓，李燕濤，李誠，等. 混料設計優(yōu)化牦?！扒蹦槊父衫宜氐墓に嚰爱a(chǎn)品的性質(zhì)分析[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2020，46（6）：172-179.

[11]管方方. 牛乳中摻假大豆蛋白的SDS-PAGE方法研究[D]. 上海：上海應用技術學院，2015.

[12]李林強，朱莉莉，萬威，等. 牛羊乳熱處理蛋白質(zhì)變性程度比較及機理分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2016，44（11）：149-154，160.

[13]孔繁華，曹雪妍，康世墨，等. 基于多重光譜技術的木糖醇與牛乳酪蛋白相互作用及對酪蛋白結構的影響[J]. 食品科學，2019，40（16）：75-82.

[14]WEE M S M， LOUD D E， TAN V W K， et al. Physical and sensory characterisation of noodles with added native and denatured pea protein isolate[J]. Food Chemistry， 2019， 294： 152-159.

[15]胡濤，丁波，顧利，等. 曲拉制酪蛋白酸鈉的工藝研究及功能性評價[J]. 食品工業(yè)科技，2019，40（19）：61-66.

[16]DU M X， XIE J H， GONG B， et al. Extraction， physicochemical characteristics and functional properties of Mung bean protein[J]. Food Hydrocolloids， 2018， 76： 131-140.

[17]JIANG S J， ZHAO X H. Transglutaminase-induced cross-linking and glucosamine conjugation of casein and some functional properties of the modified product[J]. International Dairy Journal，2011， 21（4）： 198-205.

[18]MIR N A， RIAR C S， SINGH S. Effect of pH and holding time on the characteristics of protein isolates from Chenopodium seeds and study of their amino acid profile and scoring[J]. Food chemistry， 2019， 272： 165-173.

[19]LONCHAMP J， CLEGG P S， EUSTON S. Foaming， emulsifying and rheological properties of extracts from a co-product of the Quorn fermentation process[J]. European Food Research and Technology， 2019， 245（9）： 1825-1839.

[20]VIOQUE J， SNCHEZ-VIOQUE R， CLEMENTE A， et al. Partially hydrolyzed rapeseed protein isolates with improved functional properties[J]. Journal of the American Oil Chemists Society， 2000， 77（4）： 447-450.

[21]MUNDI S， ALUKO R E. Physicochemical and functional properties of kidney bean albumin and globulin protein fractions[J]. Food Research International， 2012， 48（1）： 299-306.

[22]SELLE Y D， MOSS P H， WANG A F， et al. Influence of starch sources and dietary protein levels on intestinal functionality and intestinal mucosal amino acids catabolism in broiler chickens[J]. Journal of Animal Science and Biotechnology， 2019， 10（3）： 658-672.

[23]SANDRA S M， ALEXANDER M， DALGLEISH D G. The rennet coagulation mechanism of skim milk as observed by transmission diffusing wave spectroscopy[J]. Journal of Colloid and Interface Science， 2013， 308（2）： 364-373.

[24]李曉暉. 牛乳中酪蛋白的結構特性及其應用[J]. 食品工業(yè)，2001（1）：29-31.

[25]許銘珠. 葡萄皮花青素提取物與蛋白質(zhì)的相互作用及其對色素穩(wěn)定性的影響[D]. 無錫：江南大學，2015.

[26]PRUCHNIK H， BONARSKA-KUJAWA D， Z·YLKA R， et al. Application of the DSC and spectroscopy methods in the analysis of the protective effect of extracts from the blueberry fruit of the genus Vaccinium in relation to the lipid membrane[J]. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry， 2018， 134（1）： 679-689.

[27]CHEN W J， LV R L， WANG W J， et al. Time effect on structural and functional properties of whey protein isolate-gum acacia conjugates prepared via Maillard reaction[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2019， 99（10）： 4801-4807.

[28]CHEN C， MICHAEL M， PHEBUS R K， et al. Short communication： radio frequency dielectric heating of nonfat dry milk affects solubility and whey protein nitrogen index[J]. Journal of Dairy Science， 2013， 96（3）： 1471-1476.

[29]CHEE K L， LING H K， AYOB M K. Optimization of trypsin-assisted extraction， physic-chemical characterization， nutritional qualities and functionalities of palm kernel cake protein[J]. LWT-Food Science and Technology， 2012， 46（2）： 419-427.

[30]MARIA Y， CHI T T， LIEN H H， et al. Isolation and characterization of protein isolated from defatted cashew nut shell： influence of pH and NaCl on solubility and functional properties[J]. LWT-Food Science and Technology， 2014， 55（2）： 621-626.

[31]BRITTEN M， GIROUX H J， JEAN Y， et al. Composite blends from heat-denatured and undenatured whey protein： emulsifying properties[J]. International Dairy Journal， 1994， 4（1）： 25-36.

[32]ZHAO Q， XIONG H， SELOMULYA C， et al. Effects of spray drying and freeze drying on the properties of protein isolate from rice dreg protein[J]. Food and Bioprocess Technology， 2013， 6（7）： 1759-1769.

[33]MALOMO S A， ALUKO R E. Conversion of a low protein hemp seed meal into a functional protein concentrate through enzymatic digestion of fibre coupled with membrane ultrafiltration[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies， 2015， 31： 151-159.

[34]SNCHEZ C S， PATINO J M R. Interfacial， foaming and emulsifying characteristics of sodium caseinate as influenced by protein concentration in solution[J]. Food Hydrocolloids， 2005， 19（3）： 407- 416.

[35]DELGADO E，VALVERDE-QUIROZ L， LOPEZ D， et al. Characterization of soluble glandless cottonseed meal proteins based on electrophoresis， functional properties， and microscopic structure[J]. Journal of Food Science， 2019， 84（10）： 2820-2830.

[36]任秀艷，王孟云，曹戈，等. 玉米胚芽粕蛋白功能特性研究[J]. 食品科技，2014，39（6）：187-192.

[37]趙小龍，劉大川. 棉籽分離蛋白的功能特性研究[J]. 中國油脂，2015，40（1）：27-30.

[38]DE ALMEIDA N M， DE MOURA BELL J M L N， JOHNSON L A. Properties of protein produced by countercurrent， two-stage， enzyme-assisted aqueous extraction[J]. Journal of the American Oil Chemists Society， 2014， 91（6）： 1077-1085.

[39]TAN E S， YING-YUAN N， GAN C Y. A comparative study of physicochemical characteristics and functionalities of pinto bean protein isolate （PBPI） against the soybean protein isolate （SPI） after the extraction optimisation[J]. Food Chemistry， 2014， 152： 447-455.

（責任編輯：徐艷）