周菁， 郭麗

(1. 陜西省腫瘤醫(yī)院腫瘤科， 陜西 西安 710061； 2. 空軍第九八六醫(yī)院干部病房科， 陜西 西安 710054)

小細(xì)胞肺癌(small cell lung carcinomas, SCLC)是肺癌的一個(gè)亞型，約占肺癌的15%，但其5年生存率僅有1%～2%，明顯低于其他類型的肺癌[1]。因此，探討SCLC轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于預(yù)防其復(fù)發(fā)至關(guān)重要。近年來，眾多學(xué)者對(duì)SCLC的病理機(jī)制進(jìn)行了深入探究，并開發(fā)了多種治療SCLC的靶向藥物，主要針對(duì)Notch信號(hào)通路、酪氨酸激酶受體、免疫檢查點(diǎn)、凋亡信號(hào)通路等相關(guān)的靶點(diǎn)[2]。

Notch信號(hào)通路激活后可以抑制SCLC癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。DLL3作為Notch家族的一員，可以抑制Notch信號(hào)通路的激活[3]。研究表明，DLL3在SCLC細(xì)胞表面呈高度上調(diào)，一項(xiàng)臨床報(bào)道發(fā)現(xiàn)83%的SCLC腫瘤患者DLL3呈陽性，其中32%高表達(dá)，這表明DLL3可能是治療該疾病的潛在靶點(diǎn)[4]。目前關(guān)于DLL3在SCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制研究并不多，最近有報(bào)道稱DLL3通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關(guān)蛋白Snail促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲[5]。本研究通過收集SCLC患者的臨床信息，分析DLL3在癌組織與癌旁組織中的表達(dá)，并探討DLL3促進(jìn)SCLC轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 收集陜西省腫瘤醫(yī)院2017年1月至2018年12月手術(shù)切除的SCLC組織及其癌旁組織50例，所有病例經(jīng)病理學(xué)確診。本研究經(jīng)由陜西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素(美國Gibco公司)；SCLC細(xì)胞系H592、正常支氣管上皮細(xì)胞HBE(廣州吉妮歐生物科技有限公司)；DLL3，MUC-1, Snail, GAPDH抗體(英國Abcam公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；凋亡檢測Annexin V FITC-PI試劑盒(北京欣博盛生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H592和HBE均培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，并加入終濃度為1%的青霉素和鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測組織中DLL3的表達(dá) 組織切片采用二甲苯脫蠟，乙醇脫水，高pH抗原修復(fù)液修復(fù)抗原。自然冷卻后，取出切片，PBS緩沖液沖洗3次，3%過氧化氫封閉30 min，用EDTA抗原提取緩沖液在微波爐中加熱切片進(jìn)行抗原提取。室溫下，將切片用10%的山羊血清封閉30 min。加入一抗DLL3抗體4 ℃孵育過夜；滴加HRP偶聯(lián)的二抗，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。根據(jù)陽性染色細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行打分，將患者分為低表達(dá)DLL3(≤3分)組和高表達(dá)DLL3(>3分)組。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測DLL3、MUC-1的mRNA表達(dá) 從獲取的SCLC組織以及癌旁組織提取RNA，采用RNAprep Pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取RNA。從處于對(duì)數(shù)生長期的SCLC細(xì)胞系H592中提取RNA，采用RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取總RNA。測量D(260 nm/280 nm)評(píng)估RNA的質(zhì)量。取1 μg RNA作為模板，采用FastKing一步法逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒檢測DLL3 mRNA水平，以GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min預(yù)變性；95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 35個(gè)循環(huán)。DLL3上游引物：5′-CACTCCCGGATGCACTCAAC-3′；下游引物：5′-GATTCCAATCTACGGACGAGC-3′。MUC-1上游引物：TGCCGCCGAAAGAACTACG；下游引物：TGGGGTACTCGCTCATAGGAT。GAPDH上游引物： 5′-CTGACTTCAACAGCGACACC-3′；下游引物：5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3′。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡檢測DLL3、MUC-1、Snail蛋白的表達(dá)水平 收集H592細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min、4 ℃離心20 min。取上清液采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量分析。每組取50 μg蛋白上樣于SDS-PAGE膠上，160 V運(yùn)行1 h。隨后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗DLL3(1 ∶2 000)，MUC-1 (1 ∶ 1 000), Snail (1 ∶ 1 000), GAPDH (1 ∶ 5 000) 4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，二抗室溫孵育2 h。ECL發(fā)光液曝光、顯影。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將H592細(xì)胞按照2×105個(gè)/孔的密度接種到6孔板中，孵育24 h。采用脂質(zhì)體LipofectamineTM3000將si-NC、si-DLL3、si-MUC-1轉(zhuǎn)染至H592細(xì)胞，操作過程按照說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染成功48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 取處于對(duì)數(shù)生長期的H592細(xì)胞100 μL接種于96孔板中，孵育過夜。向每孔加入10 μL的CCK-8溶液進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)檢測。采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的光密度。測量時(shí)間點(diǎn)為0、12、24、48 h。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h后的H592細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測。500 r/min離心5 min收集H592細(xì)胞，PBS重懸；加入3 μL Annexin-V-FITC，輕輕混勻后加入終濃度為1 μg/mL的碘化丙啶，4 ℃避光孵育10 min。離心后100 μL PBS重懸，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 將H592細(xì)胞以5×104的密度接種于不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，取300 μL加入到Transwell小室上層，下層加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。孵育48 h后，用棉簽將上層小室內(nèi)的細(xì)胞擦去，甲醇和丙酮(1 ∶ 1)固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移數(shù)，隨機(jī)選取10個(gè)視野，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DLL3在SCLC組織及癌旁組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，SCLC組織中DLL3呈現(xiàn)較強(qiáng)的表達(dá)，且主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，而癌旁組織中DLL3基本不表達(dá)。SCLC組織中DLL3陽性表達(dá)率為72%(36/50)，其中高表達(dá)的有22%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，癌組織中DLL3的mRNA表達(dá)較癌旁組織顯著提高(Z=7.62,P<0.01)。見圖1、圖2。

圖1 免疫組化染色檢測SCLC組織及癌旁組織中DLL3的表達(dá)(×200)

圖2 實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測SCLC組織及癌旁組織中DLL3的表達(dá)

2.2 DLL3在SCLC細(xì)胞系H592中的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，DLL3在H592細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于HBE細(xì)胞(t=21.63,t=43.62，P均<0.01)，提示DLL3在SCLC中表達(dá)上調(diào)。見圖3、圖4。

圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測SCLC細(xì)胞H592中DLL3的蛋白表達(dá)

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SCLC細(xì)胞H592中DLL3的mRNA表達(dá)

2.3 下調(diào)DLL3抑制H592細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-DLL3組DLL3的mRNA表達(dá)顯著降低(t=79.95,P<0.01)。提示，si-DLL3組中H592細(xì)胞的DLL3基因被抑制，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖5。

圖5 siRNA干擾后H592細(xì)胞DLL3 mRNA表達(dá)

CCK-8檢測H592細(xì)胞活力結(jié)果顯示，與si-NC組比較，在48 h 時(shí)si-DLL3組的細(xì)胞活力明顯降低(t=14.07,P<0.01)，而si-NC組與空白對(duì)照組間無明顯差異。見圖6。si-DLL3轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與si-NC相比，si-DLL3組細(xì)胞凋亡能力明顯增強(qiáng)(t=133.60,P<0.01)；而si-NC組與空白對(duì)照組間無明顯差異。見圖7。

a:P<0.01,與si-NC組比較

圖7 下調(diào)DLL3對(duì)H592細(xì)胞凋亡的影響

2.4 下調(diào)DLL3抑制H592細(xì)胞遷移

轉(zhuǎn)染48 h后Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-DLL3組細(xì)胞穿膜的垂直遷移能力顯著低于si-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.25,P<0.01)；而si-NC組與空白對(duì)照組間無明顯差異。見圖8。

圖8 下調(diào)DLL3對(duì)H592細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

2.5 DLL3與MUC-1表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-DLL3組MUC-1 mRNA蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(t=36.13,P<0.01)；而Snail蛋白表達(dá)無差異(t=0.35,P=0.74)。見圖9。

圖9 蛋白質(zhì)印跡檢測MUC-1和Snail蛋白的表達(dá)

進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測MUC-1 mRNA在SCLC組織及癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示與癌旁組織相比，癌組織中MUC-1的mRNA表達(dá)水平顯著提高(Z=9.63,P<0.01)。見圖10。

圖10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測癌組織及癌旁組織中MUC-1的mRNA表達(dá)

Pearson相關(guān)性分析顯示，在SCLC癌組織中DLL3與MUC-1的mRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.83,P<0.01)。提示DLL3可能通過調(diào)控MUC-1促進(jìn)SCLC的增殖與遷移。見圖11。

圖11 MUC-1與DLL3 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.6 下調(diào)MUC-1抑制H592細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)凋亡

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-MUC-1組MUC-1的mRNA表達(dá)顯著降低(t=27.24,P<0.01)。表明si-MUC-1組中MUC-1基因被抑制，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖12。CCK-8檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-MUC-1組24 h(t=5.81,P<0.05)和48 h(t=6.63,P<0.01)的細(xì)胞活力均明顯降低，而si-MUC-1組與空白對(duì)照組間無明顯差異。見圖13。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-MUC-1組細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.47,P<0.01)；而si-NC組與對(duì)照組間無明顯差異。見圖14。Transwell結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-MUC-1組H592細(xì)胞遷移能力明顯下降(t=7.58,P<0.01)；而si-NC與對(duì)照組間無明顯差異。見圖15。上述結(jié)果表明下調(diào)MUC-1可以抑制SCLC細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)凋亡。

圖12 siRNA干擾后H592細(xì)胞MUC-1 mRNA表達(dá)

a: P<0.05, b: P<0.01，與si-NC組比較

圖14 下調(diào)MUC-1對(duì)H592細(xì)胞凋亡的影響

圖15 下調(diào)MUC-1對(duì)H592細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

3 討論

SCLC是一種惡性腫瘤，具有生長快、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差的特點(diǎn)。目前鉑類藥物是其主要治療藥物，但幾乎所有患者3個(gè)月內(nèi)都會(huì)復(fù)發(fā)。DLL3作為Notch配體抑制劑，在SCLC中通過阻滯Notch信號(hào)通路激活來促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖擴(kuò)散。Rova-T是一類靶向DLL3的抗體偶聯(lián)藥物，在SCLC治療中展現(xiàn)出一定的抗腫瘤效果[6]。DLL3可能是治療SCLC的靶點(diǎn)，目前關(guān)于其在SCLC進(jìn)展中的分子機(jī)制并不明確。

近期有學(xué)者指出DLL3高表達(dá)的晚期SCLC患者呈現(xiàn)較短的無進(jìn)展生存期和總生存期；下調(diào)DLL3抑制了EMT，導(dǎo)致SCLC細(xì)胞的增殖、遷移能力減弱，提示靶向DLL3有助于防止SCLC的轉(zhuǎn)移[7]。但是由于Notch信號(hào)通路在不同的腫瘤類型中發(fā)揮不同的作用[8]，DLL3可能根據(jù)不同癌癥類型扮演不同的角色，比如在肝癌中發(fā)現(xiàn)DLL3啟動(dòng)子甲基化會(huì)促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，提示DLL3在肝癌中可能是抑癌基因[9]。本研究證實(shí)了DLL3在SCLC癌組織中呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，DLL3陽性率為72%，高表達(dá)率為22%。DLL3下調(diào)后能抑制SCLC細(xì)胞H592增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

最近有研究證實(shí)在SCLC中DLL3通過調(diào)控Snail來促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[5]。本文也分析了DLL3調(diào)控SCLC細(xì)胞所介導(dǎo)的信號(hào)途徑，發(fā)現(xiàn)敲減DLL3前后Snail表達(dá)無明顯變化，但與EMT相關(guān)的另一個(gè)蛋白分子MUC-1的表達(dá)出現(xiàn)了明顯變化。表明在該細(xì)胞系中DLL3有可能通過調(diào)控MUC-1促進(jìn)EMT進(jìn)程。MUC-1是黏蛋白家族的一員，其過度表達(dá)會(huì)促進(jìn)上皮來源的腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的可遷移能力，即促進(jìn)EMT進(jìn)程。目前已證實(shí)MUC-1在肺癌[10]、乳腺癌[11]、結(jié)直腸癌[12]、胰腺癌[13]和多發(fā)性骨髓瘤[14]等表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究表明，MUC-1在SCLC癌組織中呈高表達(dá)，推測在SCLC中DLL3通過調(diào)控MUC-1促進(jìn)EMT進(jìn)程，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。SCLC患者中MUC-1與DLL3表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)的結(jié)果間接證實(shí)了我們的推測。進(jìn)一步敲減MUC-1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H592細(xì)胞的遷移能力明顯降低，表明下調(diào)MUC-1可以抑制腫瘤的遷移。

本研究證實(shí)了DLL3和MUC-1在SCLC組織中表達(dá)上調(diào)，敲減DLL3和MUC-1會(huì)抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)凋亡，推測在SCLC中DLL3通過調(diào)控MUC-1促進(jìn)EMT進(jìn)程，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。