李心丹，馬佳宏，王文軍，曾凱芳,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

柑橘類水果在貯藏過程中易被真菌侵染而發(fā)病，造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。其中，由指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的綠霉病是柑橘貯藏期主要的侵染性病害之一[2]。目前，人們多采用抑霉唑、咯菌腈和咪鮮胺等傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑來控制綠霉病害。但化學(xué)殺菌劑會(huì)威脅到環(huán)境和人體健康，并可能使病原菌產(chǎn)生耐藥性，這使其應(yīng)用受到一定限制[3-4]。近年來，抗菌肽因具有廣譜抑菌性、對(duì)宿主細(xì)胞低毒性和不易誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，得到越來越多的關(guān)注，研究人員期待能將抗菌肽開發(fā)為一種可替代化學(xué)殺菌劑的新型藥物或防治方法[5-8]。

Jelleine-I（PFKLSLHL-NH2）是一種從蜜蜂（Apis mellifera）蜂王漿中分離得到的抗菌肽[9]。前期研究表明，Jelleine-I能有效控制柑橘果實(shí)綠霉病的發(fā)生，且對(duì)血紅細(xì)胞幾乎無溶解性[10]。此外，Jelleine-I對(duì)細(xì)菌和酵母也具有獨(dú)特的抑菌活性[11-12]。Jelleine-I的廣譜抑菌性和低溶血性使其具有極大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。但在抗菌肽的研究過程中，研究者們發(fā)現(xiàn)抗菌肽的抑菌活性容易受到溫度、pH值、陽離子和蛋白酶等的影響[13-15]，這將嚴(yán)重阻礙抗菌肽在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。然而，關(guān)于Jelleine-I對(duì)P. digitatum的抑菌穩(wěn)定性尚不清晰。為提高現(xiàn)有抗菌肽的抑菌活性，獲得更多能有效抑菌的抗菌肽，研究者們開始致力于改造抗菌肽，如替換多肽序列某些位點(diǎn)的氨基酸、修飾氨基酸、連接天然抑菌物質(zhì)和形成雜合肽等[16-22]。但對(duì)于抗菌肽Jelleine-I的改造，僅限于對(duì)序列中苯丙氨酸進(jìn)行鹵化修飾[12]，其他改造方法鮮見報(bào)道。

前期研究表明，抗菌肽Jelleine-I能抑制P. digitatum的生長，最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為6.25 μmol/L[10]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過研究不同因素對(duì)抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響，評(píng)價(jià)Jelleine-I的抑菌穩(wěn)定性。同時(shí)，通過將有抑菌活性的脂肪酸[23-24]、肉桂酸（cinnamic acid，cin）[25]和對(duì)羥基肉桂酸（p-hydroxy cinnamic acid，pHCA）[26]與Jelleine-I連接形成脂肽，評(píng)價(jià)脂肽對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病的控制效果，從而為拓寬抗菌肽Jelleine-I的應(yīng)用范圍和防治柑橘采后綠霉病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

實(shí)驗(yàn)所用柑橘品種為‘錦橙447’（Citrus sinensic(L.)Osbeckcv.Jingcheng 447#），采摘于重慶市北碚區(qū)果園，采摘后當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。選用大小、顏色、形狀和質(zhì)量均勻、無機(jī)械傷的果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料。

指狀青霉分離于自然發(fā)病的豐臍果實(shí)，并通過分子生物學(xué)方法鑒定，為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。使用前接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA），25 ℃培養(yǎng)7 d，收集孢子并用無菌水調(diào)至所需濃度。

以抗菌肽Jelleine-I為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的一系列脂肽（表1），于南京金斯瑞公司使用固相合成方法進(jìn)行化學(xué)合成，純度均大于90%。

表1 實(shí)驗(yàn)所用抗菌肽序列和保留時(shí)間Table 1 Sequences and retention time of peptides used in the experiments

蛋白酶K、胰蛋白酶、β-胰凝乳蛋白酶 上海麥克林生化科技有限公司；瓊脂粉 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM30R立式高壓滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；XB-K-25型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 上海求精生化試劑有限公司；SYNERGYH1MG全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；WH-2漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溫度對(duì)抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

實(shí)驗(yàn)參照Thery等[27]的方法并進(jìn)行了一定的修改。將Jelleine-I干粉用無菌水配制10 MIC的溶液，分別在40、50、60、70、80 ℃下靜置15 min后，快速冷卻至室溫。以常溫下靜置15 min的10 MIC Jelleine-I溶液為對(duì)照，將180 μL含有20 倍稀釋馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）的P. digitatum孢子懸浮液（1×104CFU/mL）和20 μL的抗菌肽Jelleine-I溶液（10 MIC）進(jìn)行混合，使Jelleine-I的終濃度達(dá)到MIC?；旌虾罅⒓醇尤?6 孔板中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h后經(jīng)酶標(biāo)儀測定OD600nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2 pH值對(duì)抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

實(shí)驗(yàn)參照Wu Guoqiu等[15]的方法并進(jìn)行一定的修改。用5 mol/L的HCl或者NaOH溶液將抗菌肽Jelleine-I溶液（10 MIC）的pH值分別調(diào)節(jié)至3、4、5、6、7、8、9、10，室溫靜置1 h后，調(diào)節(jié)pH值至7.0。以不調(diào)節(jié)pH值的Jelleine-I溶液（10 MIC）為對(duì)照，按1.3.1節(jié)的方法測定OD600nm。

1.3.3 陽離子對(duì)抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

實(shí)驗(yàn)參考López-García[28]和Boziaris[29]等的方法并進(jìn)行一定修改。配制不同濃度的KCl、NaCl和CaCl2溶液，121 ℃滅菌20 min。將不同濃度的KCl、NaCl和CaCl2溶液與抗菌肽Jelleine-I溶液進(jìn)行混合，使Jelleine-I終濃度為10 MIC，KCl終濃度分別為5、20、35、50 mmol/L，NaCl終濃度分別為50、100、150、200 mmol/L，CaCl2終濃度分別為1、5、25、125 mmol/L。實(shí)驗(yàn)以不加陽離子的Jelleine-I溶液（10 MIC）為對(duì)照，按1.3.1節(jié)的方法測定OD600nm。

1.3.4 蛋白酶對(duì)抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

實(shí)驗(yàn)參考Kim[30]和Zhao Yanyan[31]等的方法并進(jìn)行一定修改。將蛋白酶K、胰蛋白酶和β-胰凝乳蛋白酶用50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）進(jìn)行溶解，并進(jìn)行10 倍梯度稀釋。將不同質(zhì)量濃度的蛋白酶溶液與Jelleine-I溶液混合，使Jelleine-I終濃度為10 MIC，蛋白酶的終質(zhì)量濃度分別為1、10-1、10-2、10-3、10-4mg/mL，并在37 ℃條件下反應(yīng)4 h，以80 ℃滅活處理5 min。實(shí)驗(yàn)以不進(jìn)行蛋白酶處理的Jelleine-I溶液（10 MIC）為對(duì)照，按1.3.1節(jié)的方法測定OD600nm。

1.3.5 抗菌肽Jelleine-I系列脂肽對(duì)P. digitatum生長抑制的劑量曲線

實(shí)驗(yàn)參照J(rèn)ia Fengjing等[11]的方法并進(jìn)行一定修改。將180 μLP. digitatum孢子懸浮液（1×104CFU/mL，含20 倍稀釋的PDB）和20 μL抗菌肽溶液混合，再立即加入96 孔板中，使抗菌肽的終濃度分別為0、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50 μmol/L和100 μmol/L，然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后用酶標(biāo)儀測定其OD600nm。以48 h時(shí)抗菌肽依舊能完全抑制病原菌生長的最低濃度作為MIC。

1.3.6 抗菌肽Jelleine-I系列脂肽對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病的控制效果

實(shí)驗(yàn)參照Zhou Yahan等[32]的方法并進(jìn)行一定的修改。果實(shí)用體積分?jǐn)?shù)2%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min，清水沖洗干凈后室溫晾干。果實(shí)表面赤道部位用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液擦拭消毒后，用無菌打孔器在果實(shí)赤道對(duì)稱部位打兩個(gè)孔（直徑4 mm、深3 mm）。將新鮮孢子懸浮液與抗菌肽溶液混合后，立即接種10 μL混合液（孢子懸浮液濃度為1×104CFU/mL、抗菌肽濃度為100 μmol/L）于每孔中。實(shí)驗(yàn)以無菌水為陰性對(duì)照組，Jelleine-I為陽性對(duì)照組，P1、P2、P3、P4、P5和P6為處理組。每組處理15 個(gè)果實(shí)，重復(fù)3 次。待液體完全吸收后，用聚乙烯薄膜袋（170 mm×140 mm）將果實(shí)單果包裝，置于25 ℃、相對(duì)濕度90%～95%的環(huán)境中貯藏，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病斑直徑。當(dāng)果實(shí)傷口區(qū)以外腐爛區(qū)超過1 mm寬時(shí)，被認(rèn)為是發(fā)病的果實(shí)。發(fā)病率為腐爛果數(shù)和總果數(shù)的比值，病斑直徑為腐爛區(qū)的測量直徑。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2013軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，運(yùn)用Graph Pad Prism 5軟件和Adobe Photoshop CS 6軟件制圖；用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用Duncan’s多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

圖1 不同溫度對(duì)抗菌肽Jelleine-I抑制P. digitatum的影響Fig. 1 Effect of different temperatures on the antifungal activity of peptide Jelleine-I against P. digitatum

隨著P. digitatu培養(yǎng)時(shí)間的延長，孢子開始萌發(fā)，孢子萌發(fā)后的菌絲會(huì)懸浮在培養(yǎng)液中，使OD600nm增加。因此，OD600nm與P. digitatum的生長呈正相關(guān)，與Jelleine-I的抑菌活性呈負(fù)相關(guān)。由圖1可知，各處理組的OD600nm與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05）。表明抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum的抑菌活性不受溫度（40～80 ℃）的影響，Jelleine-I具有熱穩(wěn)定性。

2.2 pH值對(duì)抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

圖2 不同pH值對(duì)抗菌肽Jelleine-I抑制P. digitatum的影響Fig. 2 Effect of different pHs on the antifungal activity of peptide Jelleine-I against P. digitatum

如圖2所示，抗菌肽Jelleine-I在不同pH值條件下處理1 h后，其對(duì)P. digitatum的生長抑制作用與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）。表明抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum的抑菌活性不受pH值的影響，Jelleine-I具有酸堿穩(wěn)定性。

2.3 陽離子對(duì)抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

圖3 陽離子K＋（A）、Na＋ （B）和Ca2＋（C）對(duì)抗菌肽Jelleine-I抑制P. digitatum的影響Fig. 3 Effects of K+ (A), Na+ (B) and Ca2+ (C) on the antifungal activity of peptide Jelleine-I against P. digitatum

如圖3A所示，在不同濃度的K＋溶液中，抗菌肽Jelleine-I仍能保持對(duì)P. digitatum的抑制作用，且抑菌活性與對(duì)照無顯著性差異（P＞0.05）。由圖3B可知，Jelleine-I經(jīng)Na＋處理后，僅在高濃度Na＋溶液（200 mmol/L）中，Jelleine-I對(duì)P. digitatum的抑菌活性減弱，抑菌活性與對(duì)照組存在顯著性差異（P＜0.05）。由圖3C可知，存在Ca2＋的條件下，Jelleine-I的抑菌活性隨著溶液中Ca2＋濃度的增加出現(xiàn)減弱現(xiàn)象。結(jié)果表明，不同陽離子會(huì)對(duì)Jelleine-I的抑菌活性產(chǎn)生不同的影響。

2.4 蛋白酶對(duì)抗菌肽Jelleine-I抑菌活性的影響

圖4 不同蛋白酶對(duì)抗菌肽Jelleine-I抑制P. digitatum的影響Fig. 4 Effects of different proteases on the antifungal activity of peptide Jelleine-I against P. digitatum

如圖4所示，經(jīng)3 種低質(zhì)量濃度（10-4mg/mL）蛋白酶處理后，Jelleine-I抑菌活性不發(fā)生改變。但隨著蛋白酶質(zhì)量濃度的增加，Jelleine-I抑菌活性逐漸減弱。其中，當(dāng)β-胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K的質(zhì)量濃度增加至10-3mg/mL時(shí)，Jelleine-I抑菌活性明顯減弱，與對(duì)照組比較，OD600nm分別增加了0.086和0.048。當(dāng)胰蛋白酶質(zhì)量濃度增加至0.01 mg/mL時(shí)，OD600nm增加了0.084。

2.5 抗菌肽Jelleine-I系列脂肽對(duì)P. digitatum生長抑制的劑量曲線

圖5 抗菌肽Jelleine-I系列脂肽對(duì)P. digitatum生長抑制的劑量曲線Fig. 5 Dose-response curves for growth inhibition of P. digitatum by lipopeptides derived from Jelleine-I

如圖5所示，隨著抗菌肽濃度的增加，P. digitatum的生長受到抑制的程度不斷增加。當(dāng)抗菌肽P2濃度為25 μmol/L，P5濃度為50 μmol/L，P1、P3和P6濃度均為100 μmol/L時(shí)，能完全抑制P. digitatum的生長。而抗菌肽P4在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)沒有出現(xiàn)完全抑菌的效果。因此，實(shí)驗(yàn)所用抗菌肽Jelleine-I、P1、P2、P3、P5和P6的MIC分別為6.25、100、25、100、50、100 μmol/L。

2.6 抗菌肽Jelleine-I系列脂肽對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病的控制效果

如圖6所示，在損傷接種后的3～5 d內(nèi)，Jelleine-I和所有處理組的發(fā)病率都顯著低于陰性對(duì)照無菌水處理組（P＜0.05），抗菌肽P1和P2處理組的發(fā)病率和病斑直徑與陽性對(duì)照J(rèn)elleine-I組之間無顯著性差異（P＞0.05）。在接種后4～5 d內(nèi)，抗菌肽P4、P5和P6處理組病斑直徑整體上顯著高于陽性對(duì)照J(rèn)elleine-I處理組（P＜0.05），與陰性對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）。在接種后第3天和第4天，抗菌肽P3處理組的發(fā)病率和病斑直徑與Jelleine-I處理組之間無顯著性差異（P＞0.05），在第5天時(shí)，抗菌肽P3處理組的發(fā)病率與病斑直徑分別增加至53.33%和37.28 mm，顯著高于陽性對(duì)照J(rèn)elleine-I處理組（P＜0.05）。

圖6 抗菌肽Jelleine-I系列脂肽對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病發(fā)病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig. 6 Effects of lipopeptides derived from Jelleine-I on disease incidence (A) and lesion diameter (B) of citrus fruit caused by P. digitatum

3 討 論

抗菌肽因具有廣譜抑菌性、低毒性以及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，有望成為一種能替代傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑的新型抑菌物質(zhì)。對(duì)于任何一種新型抑菌物質(zhì)，厘清其抑菌活性、抑菌穩(wěn)定性和抑菌機(jī)理對(duì)其后期的開發(fā)應(yīng)用都具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)首先探究了溫度、pH值、陽離子和蛋白酶對(duì)Jelleine-I抑菌活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在經(jīng)過不同的溫度和pH值處理后，Jelleine-I均能保持原有抑菌活性，說明Jelleine-I對(duì)P. digitatum的抑菌作用具有熱穩(wěn)定性和耐酸堿性。這與大多數(shù)抗菌肽的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性[27,33-34]一致。而Jelleine-I經(jīng)不同陽離子處理后，不同陽離子會(huì)對(duì)Jelleine-I的抑菌活性產(chǎn)生不同的影響。Jelleine-I經(jīng)一價(jià)陽離子（K＋和Na＋）處理后，僅高濃度Na＋（200 mmol/L）能減弱其抑菌活性，在其他的處理中均能保持其原有抑菌活性。而經(jīng)二價(jià)陽離子（Ca2＋）處理后，Jelleine-I抑菌活性顯著減弱。經(jīng)研究表明，現(xiàn)有的抗菌肽大部分為陽離子抗菌肽，其主要通過靜電作用與細(xì)胞膜結(jié)合后發(fā)揮作用[15,35]。然而細(xì)胞外陽離子的存在使細(xì)胞膜表面的凈電荷增加，從而減弱或者阻止了抗菌肽與細(xì)胞膜的靜電作用，最終導(dǎo)致抗菌肽抑菌活性減弱或喪失[36-38]。Jelleine-I經(jīng)不同質(zhì)量濃度的3 種蛋白酶處理后，在低質(zhì)量濃度的3 種蛋白酶中，能保持其原有的抑菌活性，但隨3 種蛋白酶質(zhì)量濃度的增加，Jelleine-I的抑菌活性逐漸減弱。因抗菌肽是由基因編碼、核糖體合成的多肽，所以其抑菌活性可能會(huì)受蛋白酶的影響[27,36,39]，在高濃度蛋白酶處理后，Jelleine-I的結(jié)構(gòu)可能被蛋白酶破壞，從而造成其抑菌活性的衰減。

基于前期研究表明，Jelleine-I能控制柑橘果實(shí)綠霉病，特異性識(shí)別宿主細(xì)胞[10]，且其抑菌活性具有熱穩(wěn)定性、耐酸堿性和對(duì)低濃度蛋白酶和一價(jià)陽離子不敏感等特性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。為了進(jìn)一步提高Jelleine-I的抑菌活性，獲得更多能有效控制柑橘果實(shí)綠霉病的抗菌肽，本實(shí)驗(yàn)將Jelleine-I與天然抑菌物質(zhì)連接形成脂肽，并研究脂肽對(duì)柑橘綠霉病的控制效果。結(jié)果表明，6 種脂肽的MIC都高于母肽Jelleine-I，且其抑菌作用均弱于母肽Jelleine-I。損傷接種實(shí)驗(yàn)中，6 種脂肽都能控制綠霉病的發(fā)生，P1和P2的控病效果與Jelleine-I無明顯差異，但其余4 種脂肽的控病能力均弱于Jelleine-I。在對(duì)多肽結(jié)構(gòu)與功能研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，多肽的氨基酸排列順序、長度、兩親性、疏水性、凈電荷和二級(jí)結(jié)構(gòu)等參數(shù)均會(huì)影響多肽的抑菌活性，其中，疏水性起著非常重要的作用[40-42]。多肽的疏水性可以通過測定多肽在反相高效液相色譜中的保留時(shí)間來確定。而在探究疏水性與抑菌活性的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，多肽的疏水性應(yīng)保持在一定范圍，疏水性過高會(huì)導(dǎo)致抗菌肽自身聚集，降低抑菌活性；疏水性過低會(huì)降低抗菌肽對(duì)膜的插入能力，降低抑菌活性[21,43]。由表1可知，實(shí)驗(yàn)中所用脂肽的保留時(shí)間都長于Jelleine-I，表明脂肽的疏水性都高于Jelleine-I，這可能也是脂肽抑菌效果弱于母肽的原因。

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，能有效控制柑橘綠霉病的抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum的抑菌活性具有熱穩(wěn)定性、耐酸堿性，對(duì)低質(zhì)量濃度蛋白酶和K＋、Na＋不敏感的特點(diǎn)，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。將天然抑菌物質(zhì)和Jelleine-I連接后，脂肽P1和P2的控病效果與Jelleine-I無明顯差異，但其余4 種脂肽可能由于疏水性過高，使其控病能力均弱于Jelleine-I。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為后期改造抗菌肽以及拓寬抗菌肽Jelleine-I的應(yīng)用范圍和防治柑橘采后綠霉病提供理論依據(jù)。