鄒 波，何廣捷，趙 迪，閆 靜，張 澤，徐幸蓮，周光宏，李春保*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

豬肉品質(zhì)與宰前應(yīng)激密切相關(guān)，應(yīng)激來源包括生豬運(yùn)輸、入欄、驅(qū)趕、季節(jié)、宰殺方式等[1-3]。不當(dāng)?shù)脑浊肮芾矸绞綍?huì)給動(dòng)物造成強(qiáng)烈應(yīng)激[4]，從而加劇機(jī)體細(xì)胞無氧呼吸程度以及肌肉能量代謝進(jìn)程，導(dǎo)致肌肉中的糖原大量消耗，乳酸迅速積累，最終造成肌肉pH值迅速下降。較低的pH值會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白變性，肌肉收縮功能改變，持水力下降，大量的水分從肌肉表面溢出，在極端情況下就會(huì)形成PSE（pale, soft, exudative）肉[5-6]。

宰前驅(qū)趕是生豬屠宰過程中必不可少的過程，其涉及屠宰場(chǎng)的眾多區(qū)域，包括卸載區(qū)域、驅(qū)趕通道以及電擊區(qū)域等[7]。國內(nèi)生豬驅(qū)趕基本以人工為主，并運(yùn)用各種輔助工具如趕豬板、電擊棍等，在宰前驅(qū)趕的方式和設(shè)備方面沒有創(chuàng)新性的發(fā)展[8]。歐美等國家有為畜禽驅(qū)趕精心設(shè)計(jì)的專用系統(tǒng)，能夠很好地保證驅(qū)趕過程溫和地進(jìn)行[9]。雖然歐美等國家在這方面設(shè)計(jì)更加精細(xì)合理，但在驅(qū)趕過程中避免不了對(duì)生豬進(jìn)行恐嚇與拍打。目前，大多數(shù)國家傳統(tǒng)的驅(qū)趕方式仍然是利用電擊、鞭打等方式驅(qū)趕生豬快速前行[10-11]，動(dòng)物應(yīng)激非常嚴(yán)重[12]。而在大型屠宰場(chǎng)，由于同一時(shí)間內(nèi)驅(qū)趕大批生豬，宰前驅(qū)趕應(yīng)激將變得更加嚴(yán)重。所以，相對(duì)溫和的驅(qū)趕方式更為合理，溫和驅(qū)趕是指避免生豬遭遇大量或強(qiáng)烈的宰前應(yīng)激驅(qū)趕方式，包括利用擋板讓生豬自由前行的完全溫和驅(qū)趕方式以及如利用聲音驅(qū)趕生豬前行的其他驅(qū)趕方式[13]。然而，關(guān)于溫和的驅(qū)趕方式如何減少宰前應(yīng)激，進(jìn)而改善肉品品質(zhì)的具體機(jī)制尚未明確。所以有必要對(duì)此進(jìn)行更深入的研究。

蛋白質(zhì)組學(xué)是一種非常重要的現(xiàn)代生物鑒定技術(shù)，可以鑒定和探究一個(gè)細(xì)胞或組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)及它們的表達(dá)方式和調(diào)控規(guī)律，是對(duì)機(jī)體在蛋白水平定量、動(dòng)態(tài)、相互作用的全面研究[14]。利用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)肌肉細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)的識(shí)別和定量，可確定它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)外的定位、活性和相互作用，進(jìn)而探索宰前驅(qū)趕應(yīng)激對(duì)肌肉細(xì)胞中催化酶或調(diào)控蛋白的調(diào)控作用，并能夠有效地闡明溫和驅(qū)趕改善肉品品質(zhì)的機(jī)制。

因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究了完全溫和驅(qū)趕、聲音溫和驅(qū)趕及傳統(tǒng)驅(qū)趕方式對(duì)生豬應(yīng)激程度、肉品品質(zhì)以及宰后肌肉能量代謝的影響，并利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析肌肉能量代謝與肌肉收縮相關(guān)的差異蛋白，旨在探索溫和驅(qū)趕改善肉品品質(zhì)的潛在機(jī)制，以期為企業(yè)的生產(chǎn)提供理論和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三元雜交公豬，180 日齡（已去勢(shì)），由江蘇某屠宰企業(yè)提供。

血清中肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌糖原試劑盒、熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、皮質(zhì)醇（cortisol，CORT）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；ATP測(cè)定試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；尿素、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES）、β-甘油磷酸鈉、釩酸鈉、焦磷酸鈉、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、三氟乙酸、甲酸 美國西格瑪奧德里奇有限公司；胰蛋白酶美國Promega公司；SEP PAK Classic C18固相萃取柱美國Waters公司；BCA試劑盒 美國Pierce公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M2e多功能酶標(biāo)儀 美國MD公司；Avanti J-E高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；pH計(jì) 德國Testo公司；漩渦儀 上海滬西分析儀器有限公司；純水機(jī)、LTQ-Orbitraq XL納升級(jí)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（nanoliquid chromatography tandem mass spectrometry，Nano-LCMS/MS） 美國Thermo公司；AUY120電子分析天平日本島津公司；均質(zhì)器破碎儀 法國Bertin公司；色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組

完全溫和驅(qū)趕（mild driving，MD）組（以下稱全溫組）：工人不對(duì)生豬進(jìn)行任何電擊和拍打行為，僅利用擋板向前推進(jìn)，生豬自由向靜養(yǎng)圈以及電擊區(qū)域移動(dòng)；聲音溫和驅(qū)趕（sound driving，SD）組（以下稱聲溫組）：工人利用驅(qū)趕聲音代替電擊棍和皮鞭，敦促生豬向前快速行走；傳統(tǒng)驅(qū)趕（traditional driving，TD）組（以下稱傳統(tǒng)組）：根據(jù)屠宰場(chǎng)現(xiàn)有驅(qū)趕流程，生豬在電擊、鞭打下進(jìn)入靜養(yǎng)和電擊區(qū)域。每個(gè)處理組15 頭生豬。電擊暈后取其血液，3 000 r/min離心10 min取上清液，獲得血清，分裝后置于-80 ℃冰箱中；同時(shí)取背最長(zhǎng)肌置于4 ℃冷庫中，分別在宰后45 min和3、12、24 h取10 g肉樣（去除筋膜、脂肪、結(jié)締組織）于凍存管，并放入液氮，之后保存于-80 ℃冰箱中用于測(cè)定糖原、ATP以及蛋白質(zhì)組學(xué)分析；剩余肉樣置于4 ℃貯存，用于測(cè)定肉色、pH值、蒸煮損失。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 血清CK活力的測(cè)定

血清CK活力測(cè)定按照試劑盒說明書的操作步驟，取20 μL血清樣品于2 mL離心管中，加入300 μL三磷酸腺苷和肌酸溶液，提供的試劑，混勻并37 ℃水浴，再加入100 μL鉬酸銨，3 500 r/min離心10 min，之后利用定磷劑顯色后，45 ℃水浴15 min，在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[15]。每個(gè)樣品測(cè)3 次，取平均值。

1.3.2.2 LDH活力的測(cè)定

LDH活力測(cè)定按照試劑盒的操作步驟，取20 μL血清于10 mL離心管中，分別加入雙蒸水、標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，再加入基質(zhì)緩沖液50 μL并于37 ℃水浴15 min，之后用250 μL 2,4-二硝基苯肼顯色并在37 ℃水浴中孵育15 min，加入2.5 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[16]。每個(gè)樣品測(cè)3 次，取平均值。

1.3.2.3 HSP70及CORT質(zhì)量濃度的測(cè)定

HSP70及CORT質(zhì)量濃度的測(cè)定按照ELISA試劑盒的操作步驟，分別將50 μL樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入含有抗體的96 孔板中，然后加入生物抗原工作液，37 ℃孵育30 min，用洗滌液清洗5 次，拍干；加入50 μL親和素-HRP，37 ℃反應(yīng)30 min，洗板5 次，再加入顯色液A、B，37 ℃顯色10 min，加入終止液，450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度[17-18]。每個(gè)樣品測(cè)3 次，取平均值。

1.3.2.4 肉的顏色測(cè)定

參照NY/T 2793—2015《肉的食用品質(zhì)客觀評(píng)價(jià)方法》[19]：沿肌纖維垂直方向切取厚度不低于2.0 cm的肉塊，將肉樣平放在紅色塑料板或托盤上，新切面朝上。之后，置于-1.5～7 ℃環(huán)境中避光靜置25～30 min。然后將色差儀的鏡頭垂直置于肉面上，鏡頭緊扣肉面（不能漏光）。測(cè)量時(shí)保持樣品表面平整，避開結(jié)締組織，分別記錄肉樣的亮度L*值、紅度a*值、黃度b*值。每個(gè)樣品重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.2.5 蒸煮損失率的測(cè)定

參照NY/T 2793—2015[19]：樣品在4 ℃冷庫中存放24 h后取出，放在室溫下平衡0.5 h。然后沿著與肌肉自然走向（肌肉的長(zhǎng)軸）垂直的方向切取2.54 cm厚的肉塊，并去除樣品表面的結(jié)締組織、脂肪和肌膜，使其表面平整。將肉塊放入塑料蒸煮袋中，將溫度計(jì)探頭由上而下插入肉塊中心，記錄肉塊的初始溫度，將蒸煮袋口密封起來。將包裝的肉塊放入72 ℃水浴中，水浴液面需完全浸沒肉塊，袋口不得浸入水中。當(dāng)肉塊中心溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，立即取出肉樣，冷卻稱質(zhì)量。肉塊蒸煮前后的質(zhì)量損失占原質(zhì)量的比例即為蒸煮損失率。每個(gè)樣品測(cè)3 次，取其平均值。

1.3.2.6 pH值測(cè)定

參照NY/T 2793—2015[19]：將校準(zhǔn)后的便攜式pH計(jì)金屬頭直接插入肉塊中（避開結(jié)締組織、血瘀和可見脂肪），待pH計(jì)讀數(shù)穩(wěn)定后，讀取數(shù)值。每個(gè)樣品測(cè)3 次，取平均值。

1.3.2.7 糖原含量測(cè)定

按照試劑盒的操作步驟稍作改進(jìn)。將肉樣從-80 ℃取出，每個(gè)肉樣取適量質(zhì)量切碎，再準(zhǔn)確稱取90 mg放入0.27 mL KOH溶液中，沸水浴20 min，再將溶液稀釋16 倍，加入顯色液，沸水浴5 min，冷卻后于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[20-21]。

1.3.2.8 ATP含量測(cè)定

切取100 mg肉樣放入ATP裂解液中，用均質(zhì)器破碎儀在低溫條件下將組織勻漿。裂解后，4 ℃、12 000×g離心5 min，取上清液用于后續(xù)測(cè)定。利用ATP標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成0.002、0.005、0.01、0.05、0.1 μg/mL的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個(gè)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品取20 μL加入ATP工作液中，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)樣品的Luminometer（RLU）值[22]。

1.3.2.9 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

每組隨機(jī)抽取8 頭生豬，對(duì)宰后45 min樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，蛋白提取采用Svinkina等[23]的方法并做適當(dāng)修改。將100 mg的肉樣放入10 mL的尿素裂解液（9 mol/L尿素、20 mmol/L HEPES、1 mmol/L β-甘油磷酸鈉、1 mmol/L釩酸鈉、2.5 mmol/L焦磷酸鈉）中勻漿，之后于20 000×g離心15 min。取1 mL上清液，加入3.6 μL 1.25 mol/L二硫蘇糖醇，55 ℃下還原30 min。加入20 μL 0.5 mol/L碘乙酰胺在20 ℃下烷基化15 min。之后用20 mmol/L HEPES（pH 8.0）將樣品稀釋4 倍，加入40 μL 1 mg/mL胰蛋白酶消化過夜。取出消化好的肽，用200 μL 20%三氟乙酸進(jìn)行酸化，并用C18脫鹽柱脫鹽純化。最后用2 mL洗脫液（含體積分?jǐn)?shù)40%乙腈、0.1%三氟乙酸）洗脫肽段，真空干燥后，-80 ℃保存。

質(zhì)譜分析按照Shi Xuebin等[24]的方法，采用LTQ-Orbitraq XL Nano-LC-MS/MS進(jìn)行分析。真空干燥后的樣品在130 μL體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液中充分溶解，利用Nano-LC系統(tǒng)將2 μg的肽段加入到C18trap column中。隨后，肽段被洗脫到Acclaim PepMap?C18分析柱中，在250 nL/min流速下運(yùn)行120 min。原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)用MaxQuant 1.5.0.30軟件分析[25]，物種為豬（Sus scrofa）（88 375 個(gè)蛋白序列）。差異表達(dá)蛋白的篩選依據(jù)是fold change不低于1.5或不高于0.667，P＜0.05。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)血液、肉品品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，用OmicsBean軟件對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同驅(qū)趕方式對(duì)血液生化指標(biāo)的影響

動(dòng)物在正常的生理情況下，細(xì)胞沒有受到損壞，其細(xì)胞膜起到屏障作用，CK與LDH主要存在于胞內(nèi)；在應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞膜遭到破壞，兩種酶會(huì)被釋放進(jìn)入到血液中[26]。與此同時(shí)，應(yīng)激刺激大腦，進(jìn)而通過邊緣系統(tǒng)、下丘腦到達(dá)腎上腺皮質(zhì)，最終導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素的分泌，其中就包括CORT[27]。由圖1可知，與傳統(tǒng)驅(qū)趕方式相比，全溫組中CK、LDH活力以及CORT質(zhì)量濃度顯著下降（P＜0.05）,而HSP70質(zhì)量濃度沒有顯著差異（P＞0.05）；聲溫組中CK、LDH活力均處于中間水平。趙慧等[28]研究生豬在強(qiáng)烈的應(yīng)激情況下同樣發(fā)現(xiàn)血液中的CK、LDH、COR含量均顯著升高，龍定彪等[29]發(fā)現(xiàn)宰前受到較低應(yīng)激的生豬，其血液中的CK、LDH活力顯著下降。

圖1 不同驅(qū)趕應(yīng)激下血液應(yīng)激指標(biāo)的變化Fig. 1 Changes in stress-related blood indicators under different driving stress conditions

2.2 不同驅(qū)趕應(yīng)激對(duì)肌肉品質(zhì)指標(biāo)的影響

表1 不同驅(qū)趕應(yīng)激對(duì)肌肉品質(zhì)的影響Table 1 Effects of different driving stress treatments on muscle quality

顏色是肉的重要品質(zhì)指標(biāo)，會(huì)影響消費(fèi)者的購買欲望[30]。由表1可以看出，全溫組和聲溫組的紅度a*值和黃度b*值都顯著高于傳統(tǒng)組（P＜0.05），而亮度L*值沒有顯著差異。這表明傳統(tǒng)組的肉色相對(duì)其他兩組更加蒼白。同樣全溫組和聲溫組的蒸煮損失率顯著低于傳統(tǒng)組（P＜0.05），持水性能更好。為了更客觀地反映兩組之間肉品質(zhì)量的差異，依據(jù)宰后45 min的pH值判定PSE肉的發(fā)生率（pH45min＜6.0）[31]，可以看出全溫組及聲溫組沒有PSE，而傳統(tǒng)組為3 例。在宰后45 min和3 h后，全溫組和聲溫組的pH值顯著高于傳統(tǒng)組（P＜0.05），宰后短時(shí)間內(nèi)pH值沒有快速下降。宰后12 h后，pH值都處于較低的值，3 組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。同樣朱良齊等[32]調(diào)研生豬宰前的環(huán)境對(duì)PSE肉發(fā)生率的影響，發(fā)現(xiàn)較為強(qiáng)烈的應(yīng)激環(huán)境之下，PSE肉發(fā)生率較高，宰后早期pH值下降迅速。

2.3 不同驅(qū)趕應(yīng)激對(duì)肌肉理化指標(biāo)的影響

圖2 不同驅(qū)趕應(yīng)激下肌肉糖原和ATP含量的變化Fig. 2 Changes in muscle glycogen and ATP contents under different driving stress conditions

動(dòng)物屠宰之后，其肌肉細(xì)胞氧氣供應(yīng)停止，細(xì)胞的呼吸方式轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧呼吸。而在屠宰之前受到較大應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致生豬體內(nèi)肌糖原和ATP消耗過度，宰后初期形成較低的pH值[31]。所以對(duì)宰后肌肉糖原和ATP的測(cè)定至關(guān)重要。宰后45 min和3 h，全溫組的糖原和ATP含量顯著高于傳統(tǒng)組（P＜0.05）（圖2）。而聲溫組中的生豬由于受到一定的應(yīng)激，其糖原和ATP含量處于中間水平。宰后12 h和24 h，全溫組的糖原含量仍然顯著高于其他兩組（P＜0.05）,但ATP含量沒有顯著性差異（P＞0.05）。這與Li Xiao等[33]研究結(jié)果類似，PSE肉發(fā)生率越高，糖原和ATP的含量下降迅速。

2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果

2.4.1 蛋白質(zhì)組整體蛋白差異分析結(jié)果

圖3A為原始的蛋白表達(dá)譜，歸一化處理后，蛋白表達(dá)量的中間值保持在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)合理的數(shù)值范圍內(nèi)（圖3B），以進(jìn)行后續(xù)分析。圖3C的主成分分析圖顯示，全溫組樣品和聲溫組樣品有一定的區(qū)分度，聲溫組受到一定的應(yīng)激，但傳統(tǒng)組樣品與其他兩組樣品呈現(xiàn)顯著差異。

2.4.2 具體差異蛋白分析結(jié)果

圖4 差異蛋白及樣品之間的差異程度Fig. 4 Analysis of proteins that differed between MD and TD groups

全溫組、聲溫組和傳統(tǒng)組總共鑒定到170 種蛋白，其中46 種蛋白發(fā)生差異表達(dá)。如ATP依賴性6-磷酸果糖激酶（ATP-dependent 6-phosphofructokinase，PFKM）、α-1,4-葡聚糖磷酸化酶（α-1,4-glucan phosphorylase，PYGM）、糖原脫支酶（glycogen debranching enzyme，AGL）等與能量代謝相關(guān)的蛋白以及MYH1、肌球蛋白7（myosin-7，MYH7）等肌肉收縮相關(guān)蛋白。圖4顯示了46 種差異蛋白在各個(gè)樣品間的具體差異程度，可以看出傳統(tǒng)組中的眾多蛋白與其他兩組區(qū)分明顯，聲溫組與全溫組中的一些蛋白也有差異。

2.4.3 差異蛋白生物功能分析結(jié)果

圖5 差異蛋白的GO功能富集分析Fig. 5 Gene ontology enrichment of differential proteins

GO（gene ontology）富集分析表明46 個(gè)差異表達(dá)蛋白富集到的286 個(gè)生物過程、64 個(gè)細(xì)胞組分和113 種分子功能產(chǎn)生差異，包括碳水化合物分解代謝過程和肌肉收縮（圖5A）。在生物過程方面，3 種處理組在單組織碳水化合物代謝過程、糖原分解代謝過程方面存在顯著差異，這些生物過程調(diào)控能量代謝，其相關(guān)的基因（蛋白）數(shù)量為2～7 個(gè)（圖5B）；圖5C顯示，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、PYGM和PFKM等蛋白在這些能量代謝生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在細(xì)胞組分方面，收縮纖維、肌原纖維等與肌肉收縮相關(guān)的細(xì)胞成分差異顯著，所涉及的基因（蛋白）數(shù)在7～31之間（圖5D），輔肌動(dòng)蛋白α2（actinin alpha 2，ACTN2）、MYH7和原肌球蛋白（tropomyosin 3，TPM3）等蛋白對(duì)細(xì)胞組分的差異有很大的貢獻(xiàn)（圖5E）。分子功能差異顯著的包括小分子結(jié)合、氨基酸結(jié)合、骨架蛋白結(jié)合等（圖5F），參與的蛋白有PYGM、ACTN2、MYH1和GAPDH等（圖5G）。

為了探究導(dǎo)致不同肉品品質(zhì)形成的具體代謝通路，需要對(duì)差異蛋白進(jìn)行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway analysis）通路分析。與傳統(tǒng)組相比，完全溫和處理和聲音溫和處理極顯著改變了碳代謝、糖酵解、緊密連接等通路途徑（P＜0.01）（圖6A）。參與調(diào)控相關(guān)代謝通路的PFKM、ACTN2、PYGM、GAPDH、TPM3、線粒體肌酸激酶2（mitochondrial creatine kinase 2，CKMT2）等蛋白下調(diào)，類突觸小泡蛋白2（synaptophysin like 2，SYPL2）、鈣調(diào)素（regucalcin，RGN）、MYH1上調(diào)（圖6B）。

圖6 差異蛋白KEGG通路分析Fig. 6 KEGG pathway analysis of differential proteins

由蛋白交互網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)23 個(gè)差異表達(dá)蛋白和10 種KEGG通路之間有相互作用。中心網(wǎng)絡(luò)圖表明與能量代謝（PFKM、AGL、異檸檬酸脫氫酶2（isocitrate dehydrogenase 2，IDH1）、CKMT2、GAPDH、磷酸甘油酸激酶1（phosphoglycerate kinase 1，PGK1）、PYGM）以及肌肉收縮相關(guān)（ACTN2、MYL1、絲切蛋白（cofilin 2，CFL2）、MYH1、MYH7、TPM3）蛋白存在眾多交互作用。其中，糖酵解、碳代謝、緊密連接等通路與蛋白之間相互作用明顯，參與調(diào)控肌肉品質(zhì)的形成（圖7）。

圖7 差異蛋白交互網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 7 Protein-protein interaction network of differential proteins

在全溫組和聲溫組中，19 種上調(diào)蛋白與細(xì)胞組分及氨基酸合成代謝相關(guān)（如腺苷高半胱氨酸酶（adenosylhomocysteinase，AHCY）、RGN、PDLIM3），維持細(xì)胞正常的生物活性。例如，AHCY參與葡萄糖醛酸鹽合成l-抗壞血酸的子通路的第3步，是催化抗壞血酸生物合成的關(guān)鍵步驟，對(duì)維持細(xì)胞的正?；钚云鹬匾饔?。另外，傳統(tǒng)組中有27 個(gè)上調(diào)蛋白與能量代謝和骨骼肌調(diào)節(jié)相關(guān)（PFKM、PYGM、GAPDH、PGK1、AGL、LDH2、ACTN2、TPM3、MYL1、CFL2）。PFKM通過ATP催化D-果糖6-磷酸為果糖-1,6-二磷酸，這是糖酵解的第一個(gè)關(guān)鍵步驟[34-35]。PYGM和AGL參與調(diào)節(jié)糖原代謝、葡萄糖代謝等多種能量通路，其表達(dá)量的增加將促進(jìn)肌肉能量代謝進(jìn)程[36-37]。GAPDH是3-磷酸甘油醛氧化反應(yīng)的催化酶，此反應(yīng)是D-甘油醛-3-磷酸合成丙酮酸第一步子途徑，對(duì)糖酵解途徑的進(jìn)程起到重要的調(diào)控作用。GAPDH能夠催化3-磷酸甘油醛氧化脫氫并磷酸化生成含有1 個(gè)高能磷酸鍵的1,3-二磷酸甘油酸，脫下的氫和電子轉(zhuǎn)給脫氫酶的輔酶NAD＋生成NADH＋和H＋。傳統(tǒng)組中GAPDH表達(dá)量的增加促進(jìn)了3-磷酸甘油醛氧化反應(yīng)。PGK1是催化1,3-二磷酸甘油酸的高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移反應(yīng)的關(guān)鍵酶。在PGK1的催化下，1,3-二磷酸甘油酸將會(huì)生成3-磷酸甘油酸，同時(shí)其C1上的高能磷酸根轉(zhuǎn)移給ADP直接生成ATP。此激酶催化的反應(yīng)是可逆的，也是D-甘油醛-3-磷酸合成丙酮酸的子途徑的第2步。傳統(tǒng)組肌肉中PGK1催化酶表達(dá)量的增加能夠?qū)⒔?jīng)過GAPDH加速催化后的糖酵解途徑進(jìn)一步加速催化，底物向丙酮酸的轉(zhuǎn)化速率不斷加快。IDH2和CKMT2也參與能量代謝，調(diào)控肌肉品質(zhì)形成。以上結(jié)果表明，傳統(tǒng)驅(qū)趕產(chǎn)生強(qiáng)烈的驅(qū)動(dòng)應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致肌肉當(dāng)中PFKM、PYFM、GAPDH、PGK1、AGL、IDH2、CKMT2等蛋白的高表達(dá)，進(jìn)而加速能量代謝。相反，完全溫和驅(qū)趕和聲音溫和驅(qū)趕可以緩解宰前應(yīng)激，抑制能量代謝相關(guān)蛋白的高表達(dá)，緩解能量代謝速率。與此同時(shí)，肌肉收縮相關(guān)蛋白也參與調(diào)控肉品品質(zhì)的形成。ACTN2和MYH7與肌動(dòng)蛋白結(jié)合和鈣離子結(jié)合有關(guān)，對(duì)肌肉收縮有重要影響。傳統(tǒng)組中這兩種上調(diào)蛋白可能改變肌肉的收縮功能，導(dǎo)致持水力下降，進(jìn)而影響肉品質(zhì)量。另外，聲音溫和組中GAPDH、AGL、PYGM等能量代謝相關(guān)的蛋白的表達(dá)量高于完全溫和組，這說明從蛋白組角度分析，聲音驅(qū)趕還是造成生豬一定程度宰前應(yīng)激并加速了糖原和ATP的部分消耗。Kiran等[38]對(duì)宰后牛肉的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)丙酮酸脫氫酶E1組分亞單位、PGK1和磷酸甘油酸突變酶2在急性宰前應(yīng)激下表達(dá)量升高，加速糖酵解過程。另外，以往的蛋白質(zhì)組研究也表明不同宰前管理方式影響與能量代謝和肌肉收縮相關(guān)的蛋白表達(dá)[39]。然而，不同類型的應(yīng)激可能導(dǎo)致不同的蛋白質(zhì)表達(dá)，特別是能量代謝和肌肉收縮相關(guān)蛋白，這需要進(jìn)一步的研究來解釋其潛在機(jī)制。綜上所述，完全溫和驅(qū)趕和聲音溫和驅(qū)趕降低了參與能量代謝和肌肉收縮相關(guān)蛋白的表達(dá)，減緩了肌肉糖原和ATP的消耗，維持了宰后肌肉正常的pH值。正常的pH值以及相對(duì)較低表達(dá)的肌肉收縮相關(guān)蛋白保證了溫和組肌肉良好的持水能力和正常的肉色，減少PSE肉的發(fā)生率（圖8）。

圖8 溫和驅(qū)趕改善豬肉品質(zhì)的潛在機(jī)制Fig. 8 Mechanism for improving pork quality by mild driving

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究了完全溫和驅(qū)趕、聲音溫和驅(qū)趕和傳統(tǒng)驅(qū)趕這3 種方式對(duì)生豬血液應(yīng)激指標(biāo)和肉品質(zhì)的影響。發(fā)現(xiàn)相對(duì)于傳統(tǒng)驅(qū)趕，完全溫和驅(qū)趕和聲音溫和驅(qū)趕能夠有效降低生豬血液應(yīng)激相關(guān)的酶活性，并降低肌肉中能量代謝和肌肉收縮相關(guān)蛋白的表達(dá)，減緩宰前肌肉能量的快速消耗，從而降低PSE肉的發(fā)生率。與此同時(shí)，聲音溫和驅(qū)趕也會(huì)帶來一定程度上的應(yīng)激。因此，肉品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)重視生豬宰前管理中的驅(qū)趕環(huán)節(jié)，做出必要的改進(jìn)以減少生豬在此環(huán)節(jié)的應(yīng)激反應(yīng)，提升肉品質(zhì)。