許夢洋，羅會(huì)婷，賈曉東*，翟 敏，莫正海，賈展慧，宣繼萍，張計(jì)育，郭忠仁

（1 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，南京 210014；2 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，南京 210014）

薄殼山核桃 ［Carya illinoinensis（Wangech.）K.Koch］種仁含油量高，油脂富含不飽和脂肪酸，如油酸（Oleic acid）為49.0%～76.5%，亞油酸（Linoleic acid）為13%～40%；而飽和脂肪酸含量很低（6%～17%）[1，2]。日常食用這種脂肪酸比例的油脂對保護(hù)心臟健康具有重要作用[3,4]。此外，薄殼山核桃還因具有良好的抗氧化性而備受關(guān)注。Wu[5]等（2004）測定美國市場上常見的100余種食品的抗氧化性，結(jié)果顯示，薄殼山核桃的抗氧化性在干果中排名第一，顯著高于其他干果。薄殼山核桃種仁的強(qiáng)抗氧化性主要來源于生育酚（Tocopherol）、甾醇（Phytosterol）及多酚（Polyphenol）等活性成分[6～10]。其中生育酚，又名維生素E（Vitamin E），是薄殼山核桃種仁中的主要抗氧化活性成分[11]，其主要功能就是作為抗氧化劑抑制多不飽和脂肪酸的氧化[12]。日常食用富含生育酚的食品可預(yù)防心腦血管疾病、阿爾茨海默癥，緩解前列腺癌和乳腺癌癥狀。生育酚還具有一定的抗炎作用[13]。

前人已對薄殼山核桃中的生育酚進(jìn)行一些研究。然而，這些研究主要集中在成熟種仁中的生育酚含量測定及不同品種比較上，關(guān)于生育酚在種仁發(fā)育早期的含量及動(dòng)態(tài)變化卻鮮有報(bào)道，這不利于對薄殼山核桃的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用。前期我們已經(jīng)對薄殼山核桃果實(shí)的形態(tài)[14]、含油率、蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素等[15]的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行研究。薄殼山核桃種仁富含生育酚，具有良好的抗氧化能力，如能明確其隨果實(shí)發(fā)育成熟的變化規(guī)律，必將對今后的果實(shí)品質(zhì)形成機(jī)理研究和品質(zhì)育種工作有重要的指導(dǎo)意義?；诖?，本文選擇5 個(gè)薄殼山核桃主栽品種，對果實(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)取樣，測定油中α-、γ-、δ-生育酚含量動(dòng)態(tài)變化，以期為今后薄殼山核桃果實(shí)品質(zhì)研究和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)于2016年在中國江蘇省南京市六合區(qū)雄州鎮(zhèn)龍虎營村江蘇省中國科學(xué)院植物研究所果樹科學(xué)研究項(xiàng)目組基地進(jìn)行。供試薄殼山核桃樹齡為7年生，品種有‘波尼’‘斯圖爾特’‘威奇塔’‘金華’和‘紹興’，株行距為6.0 m×8.0 m。每品種選取生長發(fā)育良好、樹勢相對一致的6 株，2 株1 小區(qū)，3 次重復(fù)。采樣時(shí)間為盛花后115～165 d，每隔10 d 取樣1 次。樣品取自長勢中庸的結(jié)果枝，于每株樹東、南、西、北4 個(gè)方向分別取樣，每個(gè)方向取健康、無病蟲害果實(shí)2～6 個(gè)，每株共取果實(shí)8～24 個(gè)，果實(shí)采樣量隨果實(shí)發(fā)育逐漸減少。取樣后迅速用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-20 ℃冰箱過夜后，人工剖開取種仁，-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及儀器

α-生育酚（CAS：59-02-9，LOT：MKBS2473V，純度＞96%）、γ-生育酚（CAS：54-28-4，LOT：SLBV1421，純度＞96%）、δ - 生育酚（CAS：119 -13 -1，LOT：SLBL6250V，純度＞90%），均購自Sigma-Aldrich公司。正己烷：AR級；甲醇：AR級；甲醇：色譜級。Hettich離心機(jī)（Andreas Hettich GmbH ＆ Co.KG,Germany）。Agilent 1100液相色譜儀，紫外檢測器（VWD）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）。

1.3 色譜條件

色譜條件參考Villarreal-Lozoya 等（2007）報(bào)道，略有改動(dòng)。流動(dòng)相：甲醇/水（97/3，v/v）；柱溫35°C；流速1 mL/min；檢測波長298 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.4 供試液制備

采用索氏提取法提取油脂，提取溶劑為正己烷[16]。油脂中維生素E的提取參考Villarreal-Lozoya等[17]的方法，略加改動(dòng)。具體為稱取索氏提取法得到的油脂約0.5 g，置于15 mL離心管中，加入2 mL甲醇，渦旋1 min；混合液6 000 rmp 轉(zhuǎn)速離心5 min；收集上清液，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚對照品，甲醇定容分別配成0.2、0.005及1.00 mg/mL的原液備用。逐級稀釋后依照1.3項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，根據(jù)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：α-生育酚（y=400.21x+0.581 2；R2=0.999 9）；γ-生育酚（y=518.24x-3.307 9；R2=0.999 9）；δ-生育酚（y=553.17x-0.352 3；R2=0.999 9），結(jié)果用mg·kg-1表示，即每千克油脂中生育酚的含量。

1.6 方法學(xué)研究

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取‘波尼’165 d 樣品供試液，分別在0、4、8、12、24 h 檢測；精密度實(shí)驗(yàn)取‘波尼’165 d 樣品供試液，連續(xù)進(jìn)樣5 次檢測；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取‘波尼’165 d 樣品5 份，按供試品溶液制備方法制備檢測。結(jié)果各實(shí)驗(yàn)均RSD ＜3% ，說明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定，精密度與重復(fù)性符合要求。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及動(dòng)態(tài)變化圖繪制采用Excel 軟件，相關(guān)性分析用SPSS 軟件（18.0） 處理，主成分分析應(yīng)用SIMCA-P 軟件（12.0）進(jìn)行。所有分析均重復(fù)3 次及以上，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄殼山核桃種仁中3 種生育酚的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

自然界存在α-、β-、γ-、δ-生育酚和α-、β-、γ-、δ-生育三酚（Tocotrienol）8 種形式[1]，薄殼山核桃種仁中含量較高的是α-、γ-、δ-生育酚3 種[18]。從薄殼山核桃種仁的液相色譜圖（圖1）中可看出，3 種生育酚按照出峰順序依次為δ-生育酚（9.5 min）、γ-生育酚（10.9 min）和α-生育酚（12.4 min）。

γ-生育酚在5 個(gè)品種中均為發(fā)育早期含量最高，之后逐漸降低（圖2），成熟樣品中γ-生育酚的含量與發(fā)育早期樣品相比顯著降低（p ＜0.05）。其中‘威奇塔’含量最高（191.80 mg·kg-1，115 d），‘紹興’含量最低（66.05 mg·kg-1，145 d）。成熟樣品中（盛花后155d），γ-生育酚的含量從高到低依次為‘金華’（123.60 mg·kg-1，155 d）、‘威奇塔’（115.91 mg·kg-1，155 d）、‘波尼’（95.85 mg·kg-1，155 d）、‘斯圖爾特’（78.37 mg·kg-1，165 d）、‘紹興’（71.87 mg·kg-1，165 d）。

δ-生育酚的含量在發(fā)育早期較高，‘斯圖爾特’在115 d含量最高，其他4個(gè)品種均在115 d含量最高，之后含量均逐漸降低（圖3）。其中‘金華’115 d樣品含量最高（119.61 mg·kg-1），155 d樣品含量最低（4.59 mg·kg-1）。成熟樣品中，δ-生育酚的含量從高到低依次為‘紹興’（14.71mg·kg-1，165 d）、‘斯圖爾特’（11.61 mg·kg-1，165 d）、‘波尼’（10.20 mg·kg-1，155 d）、‘威奇塔’（9.94 mg·kg-1，155 d）、‘金華’（4.59 mg·kg-1，155 d）。

各品種種仁中α-生育酚的含量也是在發(fā)育早期最高，之后迅速降低（圖4）。其中‘金華’115 d 樣品含量最高（73.92 mg·kg-1），‘波尼’145 d樣品含量最低（1.40 mg·kg-1）。成熟樣品中，α-生育酚的含量從高到低依次為‘斯圖爾特’（3.08 mg·kg-1，165 d）、‘波尼’（2.74 mg·kg-1，155 d）、‘紹興’（2.16 mg·kg-1，165 d）、‘金華’（1.79 mg·kg-1，155 d）、‘威奇塔’（1.61 mg·kg-1，155 d）。

2.2 薄殼山核桃種仁總生育酚的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

3 種生育酚的總含量總體呈現(xiàn)與單個(gè)生育酚類似的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律（表1）。發(fā)育早期最高，之后隨著果實(shí)的發(fā)育呈現(xiàn)降低的趨勢，成熟期含量與115 d 比較顯著降低（p ＜0.05）。其中‘金華’115 d 樣品總生育酚含量最高，紹興155 d 樣品含量最低。成熟樣品中，總生育酚的含量次序與γ-生育酚一致，為‘金華’‘威奇塔’‘波尼’‘斯圖爾特’‘紹興’。

2.3 薄殼山核桃不同品種生育酚含量的比較

從圖2～圖4中可以看出，不同品種α-、γ-、δ-生育酚的含量存在顯著差異，且在種仁發(fā)育早期更明顯，至發(fā)育晚期品種間的差異降低。不同品種的總生育酚在種仁發(fā)育早期差異也較大（表1），115 d 種仁含量最高的‘金華’為349.38 mg·kg-1，比含量最低的‘波尼’（196.10 mg·kg-1）高78%；而到了成熟期，含量最高的‘金華’（155 d）為129.98 mg·kg-1，比含量最低的‘紹興’（165 d，88.74 mg·kg-1）高46%。從圖5中可以更加直觀地看到，不同品種間存在顯著差異，尤其是發(fā)育早期，點(diǎn)與點(diǎn)之間距離較遠(yuǎn)，而到發(fā)育后期點(diǎn)與點(diǎn)間的距離明顯靠近，說明差異較小。單獨(dú)觀察每個(gè)品種，可看出隨著果實(shí)發(fā)育，不同發(fā)育期樣品點(diǎn)呈現(xiàn)出明顯的動(dòng)態(tài)發(fā)育軌跡，各品種均存在類似的動(dòng)態(tài)發(fā)育軌跡，說明生育酚隨薄殼山核桃種仁發(fā)育逐漸變化。

表1 薄殼山核桃種仁中總生育酚含量

2.4 生育酚指標(biāo)間的相關(guān)性

綜合各品種各發(fā)育時(shí)期樣品數(shù)據(jù)對各生育酚指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析（表2），結(jié)果顯示各生育酚指標(biāo)間均極顯著相關(guān)，其中γ-生育酚與總生育酚的相關(guān)系數(shù)最大，α-生育酚與δ-生育酚的相關(guān)系數(shù)最小。

表2 各生育酚指標(biāo)間的相關(guān)性

3 討論

生育酚作為一種天然抗氧化劑，能夠發(fā)揮類似維生素E 的功效[19]，防止多不飽和脂肪酸氧化，對人類健康具有積極功效。然而截至目前，薄殼山核桃種仁生育酚含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律報(bào)道很少。Bouali 等[12]研究了突尼斯種植的薄殼山核桃‘Burkett’品種種仁生育酚變化情況，結(jié)果顯示α-、γ-、δ-生育酚含量均在發(fā)育早期含量最高，隨種仁發(fā)育快速下降，該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)得出的變化規(guī)律一致。Rudolph 等[20]用薄層板分離美國產(chǎn)薄殼山核桃‘Stuart’和‘Schley’品種種仁的生育酚，硅烷化后氣相測定含量，結(jié)果顯示兩個(gè)品種的生育酚均隨種仁發(fā)育快速下降。這些報(bào)道及本實(shí)驗(yàn)的研究都表明，生育酚含量在薄殼山核桃種仁發(fā)育早期較高，并隨種仁發(fā)育快速下降。如δ-生育酚，盡管在‘金華’成熟樣品中其含量僅為4.59 mg·kg-1，但在發(fā)育早期樣品中可達(dá)到119.61 mg·kg-1。說明3 種生育酚在薄殼山核桃發(fā)育早期被大量合成，之后隨著種仁油脂含量的增多濃度被逐漸稀釋，或隨著種仁發(fā)育轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物，或兩種原因共同存在。

薄殼山核桃種仁成熟過程中生育酚含量的變化與飽和脂肪酸含量的變化高度一致，都是在種仁發(fā)育早期較高，隨發(fā)育快速降低，并在成熟后略微上升，而與單不飽和脂肪酸——油酸的含量變化規(guī)律剛好相反[15]。薄殼山核桃種仁發(fā)育早期的高生育酚含量可能與脂肪酸的高不飽和度密切相關(guān)[21]。隨著種仁發(fā)育成熟，種仁中的多不飽和脂肪酸含量快速下降，從而也許間接導(dǎo)致生育酚含量也下降。生育酚含量的下降還可能與對羥苯基丙酮酸雙氧化酶（p-hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase，HPPD）活性的降低有關(guān)。HPPD 是生育酚代謝途徑的關(guān)鍵酶[22]，多項(xiàng)研究表明，HPPD 活性是植物體生育酚合成的關(guān)鍵調(diào)控因素，HPPD 活性降低會(huì)影響2-methyl-6-phytyl-1,4-benzoquinol（MPBQ）和2,3-dimethyl-6-phytyl-1,4-benzoquinol（DMPBQ）的合成和積累，從而影響生育酚的合成和積累。Tsegaye 等[23]曾報(bào)道，過量表達(dá)HPPD 會(huì)引起擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉片和種子中總生育酚含量的上升。

與其他干果相比，薄殼山核桃種仁生育酚含量較高。在與杏仁、巴西堅(jiān)果、腰果、栗、松子、榛子、開心果、澳洲堅(jiān)果、核桃和花生的比較中，薄殼山核桃種仁油的γ-生育酚含量排名第二[8]，為47.29mg·100g-1。另一個(gè)對英國市場上的巴西堅(jiān)果、薄殼山核桃、松子、開心果和腰果中生育酚的比較研究結(jié)果顯示，薄殼山核桃種仁的γ-生育酚含量也排名第二[24]。Miraliakbari和Shahidi[6]比較了杏仁、巴西胡桃、榛子、松子、開心果、核桃和薄殼山核桃氯仿提取物中γ-生育酚的含量，結(jié)果顯示薄殼山核桃中含量最高。盡管結(jié)果略有不同，但能看出薄殼山核桃種仁的生育酚含量高，顯示其在人類健康領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景。

盡管薄殼山核桃種仁生育酚含量較高，但生育酚在不同薄殼山核桃品種及單株中含量變異較大，影響生育酚含量的因素也較多。Villarreal-Lozoya等[17]對6個(gè)美國產(chǎn)薄殼山核桃品種（‘Kanza’‘Nacono’‘Kiowa’‘Pawnee’‘Shawnee’和‘Desirable’）的成熟種仁生育酚含量進(jìn)行測定，γ-生育酚的含量為72～135 μg·g-1，變異系數(shù)（CV）為21.21%，其中‘波尼’的γ-生育酚含量為100 mg·kg-1，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果（95.85 mg·kg-1）接近。Chun等[25]對美國產(chǎn)3個(gè)品種（‘Desirable’‘Stuart’和‘Schley’）成熟種仁的研究表明，γ-生育酚含量為20.1～29.3mg·100g-1，α-生育酚含量為0.9～1.4 mg·100 g-1，δ-生育酚含量為0.1～0.4 mg·100 g-1，且品種間差異顯著（p ＜0.05）。Robbins 等[18]測定了美國產(chǎn)的11 個(gè)品種的生育酚含量，γ-生育酚含量為15.37～27.73 mg·100 g-1，其中‘波尼’‘斯圖爾特’和‘威奇塔’的γ-生育酚含量分別為20.44、21.22～25.16 和22.53～25.83 mg·100 g-1。Toro-Vazquez 等[16]對墨西哥三個(gè)主產(chǎn)區(qū)的薄殼山核桃種仁（品種未明確） 進(jìn)行研究，α-,γ-,δ-生育酚 分別為83.21～89.98 mg·kg-1、109.59～182.81 mg·kg-1和31.40～78.77 mg·kg-1。Rudolph等[20]對美國產(chǎn)的70 個(gè)薄殼山核桃品種發(fā)育中期種仁的研究結(jié)果顯示，發(fā)育中期生育酚的含量為131～493 μg·g-1，該實(shí)驗(yàn)為薄層板分離，硅烷化后氣相測定，其中‘Stuart’成熟種仁為40 μg·g-1。于敏等[26]測定了浙江種植的29個(gè)薄殼山核桃優(yōu)良單株中的α-生育酚的含量，結(jié)果為0.46～2.28 mg·mL-1。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近Villarreal-Lozoya等[17]和Toro-Vazquez等[16]的結(jié)果。測定方法、遺傳背景、環(huán)境因子、成熟期等均有可能影響生育酚的含量[16,20]。另外，生育酚的含量也會(huì)隨薄殼山核桃的貯存而逐漸降低[27,28]。選育高生育酚含量的薄殼山核桃品種具有顯著的健康意義，明確生育酚的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及調(diào)控因素對品質(zhì)育種及生育酚的利用具有重要意義。已有研究表明，不同薄殼山核桃品種及單株中生育酚含量變異大，生育酚在現(xiàn)有品種及單株中含量的變異為機(jī)理研究及品質(zhì)育種提供了優(yōu)良的試驗(yàn)材料。

另一方面，生育酚并不是薄殼山核桃油中唯一的抗氧化劑。已有的研究發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃油和棕櫚油含有的油脂含量及生育酚含量類似[16]，然而薄殼山核桃油比橄欖油更穩(wěn)定而不易被氧化。說明薄殼山核桃油中還含有其他的抗氧化成分，這也需要今后進(jìn)一步深入研究。