秦永燕，趙青松，劉 晨，劉建軍，劉瑞祥

(長(zhǎng)治學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 長(zhǎng)治 046011)

隨著生活水平的提高，人們對(duì)飲食和保健越來(lái)越重視，在攝取食物、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，對(duì)提高自身機(jī)體免疫力也愈加重視。中藥材因副作用小、純天然，成為養(yǎng)生保健的首選。中藥黨參(Codonopsispilosula)為桔?？泣h參屬多年生草本植物，主要分布于山西、陜西、寧夏等地。其中，產(chǎn)自山西省長(zhǎng)治地區(qū)的黨參為潞黨參，為山西道地藥材之一[1]。黨參作為一種滋補(bǔ)藥，其主要成分有多糖、生物堿和黨參苷等，具有免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞和抗癌等功效[2-3]。目前，對(duì)黨參的研究主要集中在化學(xué)成分和生物活性等方面，對(duì)其抗突變作用的研究主要以小鼠為對(duì)象。張濤等[4]利用小鼠研究發(fā)現(xiàn)，黨參多糖中CPNP-2具有良好的抗衰老作用。史寶忠等[5]研究表明，黨參多糖能夠有效提高小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1的免疫活力，增強(qiáng)小鼠的免疫功能。許朋等[6]發(fā)現(xiàn)，黨參多糖可以改善由環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下大鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，從而增強(qiáng)其免疫功能。但以植物為材料分析潞黨參抗突變作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

蠶豆根尖細(xì)胞微核檢測(cè)技術(shù)由DEGRASSI等[7]建立，具有成本低、試驗(yàn)周期短、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為誘變劑及藥物檢測(cè)提供了良好的方法[8-10]。丁燕等[11]利用蠶豆根尖細(xì)胞微核檢測(cè)技術(shù)研究了丹參的抗突變活性。因環(huán)磷酰胺是一種有效的免疫抑制劑，在臨床上常用作抗腫瘤藥物，其途徑是通過(guò)抑制細(xì)胞DNA合成，干擾細(xì)胞增殖，抑制抗體形成等，已廣泛應(yīng)用于免疫抑制[12-13]試驗(yàn)中。因此，采用蠶豆根尖微核技術(shù)及生理指標(biāo)測(cè)定方法，研究潞黨參對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)蠶豆根尖遺傳損傷的抗突變作用，為潞黨參的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

蠶豆(Viciafaba)為青皮蠶豆，購(gòu)自山東省菏澤市鄄城縣種子公司。

環(huán)磷酰胺(Cyclophoshomide，CP)為上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，用蒸餾水配制成30 mg/L。

潞黨參(Codonopsispilosula)購(gòu)自山西省長(zhǎng)治市平順?biāo)幉姆N植基地。

潞黨參水提取液的制備：潞黨參晾干，打磨成粉，稱(chēng)取50 g，加入約200 mL蒸餾水，浸泡1 h，煮沸浸提1 h，期間不斷用玻璃棒攪拌，防止過(guò)沸，過(guò)濾掉濾渣；重復(fù)提取2次，合并濾液濃縮、定容到100 mL，使其終質(zhì)量濃度為0.5 g/mL，于冰箱中貯存?zhèn)溆肹14]。

測(cè)定SOD活性和MDA含量的試劑盒編號(hào)分別為BC0170和BC0025，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 主要儀器

BSA 124S-CW電子天平購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司，TGL-20M高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，723N可見(jiàn)光分光光度計(jì)購(gòu)自上海儀電分析儀器有限公司，Spectra Max M2 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器(上海) 有限公司，恒溫培養(yǎng)箱SPX-250B-Z購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，顯微鏡Panthera L購(gòu)自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.3 蠶豆根尖培養(yǎng)

挑選大小均勻、表皮完整的蠶豆種子，洗凈后于蒸餾水中浸泡24 h，期間換水1次，待種子充分吸水、種皮脹破后，置于鋪有濕棉花的托盤(pán)中，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽。待主根長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，剪掉根尖生長(zhǎng)點(diǎn)，誘導(dǎo)次生根產(chǎn)生。待次生根長(zhǎng)度為1～2 cm時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的蠶豆置于30 mg/L環(huán)磷酰胺中染毒處理12 h，以蒸餾水培養(yǎng)為陰性對(duì)照，記作CK0，然后用不同質(zhì)量濃度(0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 g/mL)潞黨參水提液進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)12 h，各處理分別記作T1、T2、T3、T4、T5，并設(shè)蒸餾水恢復(fù)培養(yǎng)為陽(yáng)性對(duì)照，記作CK1。

1.4 蠶豆根尖微核試驗(yàn)

用蒸餾水沖洗并剪取根尖，于Carnoy固定液中固定12～24 h，然后移至70%乙醇中，置于冰箱中保存，備用。常規(guī)壓片鏡檢，每個(gè)處理選取5個(gè)根尖，每個(gè)根尖觀(guān)察1 000個(gè)分生區(qū)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其微核數(shù)，計(jì)算微核率(MCN)，MCN=(樣品的微核數(shù)×樣品觀(guān)察到的細(xì)胞數(shù))×1 000‰。

1.5 生理指標(biāo)測(cè)定

剪取1.3中培養(yǎng)的蠶豆根尖，采用比色法測(cè)定還原糖含量；采用α-萘胺法測(cè)定根系活力；采用試劑盒測(cè)定 SOD活性和MDA含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理至少重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異檢驗(yàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 潞黨參對(duì)蠶豆根尖微核率的影響

以不同質(zhì)量濃度潞黨參水提液對(duì)30 mg/L環(huán)磷酰胺處理的蠶豆根尖進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，根尖微核率的變化見(jiàn)表1。由表1可知，隨著潞黨參質(zhì)量濃度的增加，微核率呈先下降后上升的趨勢(shì)，但各處理微核率均低于陽(yáng)性對(duì)照，差異顯著(P<0.05)。當(dāng)潞黨參質(zhì)量濃度為0.10 g/mL時(shí)，微核率最低，為8.61‰，與陰性對(duì)照差異不顯著(P>0.05)，顯著低于陽(yáng)性對(duì)照(P<0.05)，抑制率為46.98%，說(shuō)明0.10 g/mL潞黨參可顯著抑制環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的蠶豆根尖微核產(chǎn)生。當(dāng)潞黨參質(zhì)量濃度高于0.10 g/mL時(shí)，微核率逐漸增加，抑制率逐漸下降，抑制作用逐漸減弱。組間差異分析表明，潞黨參質(zhì)量濃度為0.05 g/mL和0.15 g/mL處理，蠶豆根尖微核率差異不顯著(P<0.05)。根據(jù)微核率與污染程度的判定標(biāo)準(zhǔn)[15]，陽(yáng)性對(duì)照30 mg/L的環(huán)磷酰胺為輕度污染，經(jīng)0.10、0.15 g/mL潞黨參水提液處理后，可以將輕度污染降為基本沒(méi)有污染，說(shuō)明該質(zhì)量濃度潞黨參水提液抗突變作用效果顯著。

表1 潞黨參對(duì)蠶豆根尖微核率的影響 Tab.1 Effect of Codonopsis pilosula on micronucleus rate of Vicia faba root tip

2.2 潞黨參對(duì)蠶豆根尖還原糖含量的影響

以不同質(zhì)量濃度潞黨參水提液對(duì)30 mg/L環(huán)磷酰胺處理的蠶豆根尖進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，根尖還原糖含量的變化見(jiàn)表2。由表2可知，隨潞黨參質(zhì)量濃度增加，蠶豆根尖還原糖含量呈先上升后下降再上升趨勢(shì)，但均顯著高于陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照(P<0.05)。當(dāng)潞黨參質(zhì)量濃度為0.01 g/mL時(shí)， 還原糖含量較低；當(dāng)潞黨參質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時(shí)，還原糖含量最高，為2.81%，是陰性對(duì)照的1.95倍，是陽(yáng)性對(duì)照組的2.75倍。說(shuō)明潞黨參能顯著增加蠶豆根尖的還原糖含量，這可能是由于潞黨參的主要成分是黨參多糖，蠶豆根尖吸收后自身將其分解成還原糖造成的。

表2 潞黨參對(duì)蠶豆根尖還原糖含量的影響 Tab.2 Effect of Codonopsis pilosula on reducing sugar content of Vicia faba root tip

2.3 潞黨參對(duì)蠶豆根系活力的影響

以不同質(zhì)量濃度潞黨參水提液對(duì)30 mg/L環(huán)磷酰胺處理的蠶豆根尖進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，根尖根系活力的變化見(jiàn)表3。由表3可知，隨著潞黨參質(zhì)量濃度的增加，蠶豆根尖根系活力呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，均高于陰性對(duì)照，并顯著高于陽(yáng)性對(duì)照(P<0.05)。當(dāng)潞黨參質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時(shí)，根系活力最高，為120.73 μg/(g·h)，比陰性對(duì)照升高了47.45%，比陽(yáng)性對(duì)照升高了68.31%。說(shuō)明潞黨參能增強(qiáng)蠶豆根尖細(xì)胞的根系活力。

表3 潞黨參對(duì)蠶豆根系活力的影響 Tab.3 Effect of Codonopsis pilosula on root activity of Vicia faba

2.4 潞黨參對(duì)蠶豆根尖SOD活性的影響

以不同質(zhì)量濃度潞黨參水提液對(duì)30 mg/L環(huán)磷酰胺處理的蠶豆根尖進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，根尖SOD活性的變化見(jiàn)表4。由表4可知，隨著潞黨參質(zhì)量濃度增加，SOD活性呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，各處理與陽(yáng)性對(duì)照相比均差異顯著(P<0.05)。當(dāng)潞黨參質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時(shí)，SOD活性最高，為88.44 U/g，比陰性對(duì)照提高了17.29%，比陽(yáng)性對(duì)照提高了24.37%。說(shuō)明潞黨參可提高蠶豆根尖的抗氧化活性，減緩衰老，抑制環(huán)磷酰胺對(duì)蠶豆根尖的損傷。

表4 潞黨參對(duì)蠶豆根尖SOD活性的影響 Tab.4 Effect of Codonopsis pilosula on SOD activity of Vicia faba root tip

2.5 潞黨參對(duì)蠶豆根尖MDA含量的影響

以不同質(zhì)量濃度潞黨參水提液對(duì)30 mg/L環(huán)磷酰胺處理的蠶豆根尖進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，根尖MDA含量的變化見(jiàn)表5。由表5可知，隨著潞黨參質(zhì)量濃度的增加，蠶豆根尖MDA含量整體呈先下降后上升的趨勢(shì)。潞黨參各質(zhì)量濃度水提液處理根尖MDA含量均低于陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，且差異顯著(P<0.05)。當(dāng)潞黨參質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時(shí)，MDA含量最低，為13.75 nmol/g，比陰性對(duì)照降低了34.83%，比陽(yáng)性對(duì)照降低了42.59%。說(shuō)明潞黨參對(duì)蠶豆根尖的損傷有一定的修復(fù)作用。

表5 潞黨參對(duì)蠶豆根尖MDA含量的影響 Tab.5 Effect of Codonopsis pilosula on MDA content of Vicia faba root tip

3 結(jié)論與討論

植物微核技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果可靠，具有較強(qiáng)的實(shí)用性[16]。本研究采用蠶豆根尖微核檢測(cè)技術(shù)研究潞黨參水提液對(duì)30 mg/L環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)蠶豆根尖損傷的修復(fù)作用。微核試驗(yàn)結(jié)果表明，與陽(yáng)性對(duì)照相比，不同質(zhì)量濃度潞黨參水提液可不同程度地降低微核率，顯著抑制根尖細(xì)胞的遺傳損傷。潞黨參水提液質(zhì)量濃度為0.10 g/mL和0.15 g/mL時(shí)可將30 mg/L環(huán)磷酰胺對(duì)蠶豆根尖的輕度污染降為基本沒(méi)有污染，說(shuō)明潞黨參對(duì)環(huán)磷酰胺的損傷有顯著的抗突變作用。

正常情況下，機(jī)體通過(guò)產(chǎn)生和清除自由基維持正常的生理功能，但是當(dāng)環(huán)境因素發(fā)生改變時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體的抗氧化機(jī)制，保持自由基的產(chǎn)生與消除的平衡，對(duì)機(jī)體預(yù)防疾病與抗衰老等具有重要意義。根系是植株生長(zhǎng)發(fā)育的重要器官，其活力可反映植物根系整體的發(fā)育狀況，是根系生命力綜合評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[17]。當(dāng)加入不同質(zhì)量濃度潞黨參水溶液后，蠶豆根系活力和根系還原糖含量均高于陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，說(shuō)明潞黨參可為根系生長(zhǎng)提供能量，并促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育。當(dāng)潞黨參質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時(shí)，還原糖含量最高，根系活力最強(qiáng)。

抗氧化和抗衰老作用主要與機(jī)體清除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力有關(guān)。SOD作為體內(nèi)清除活性氧的主要抗氧化酶，被認(rèn)為是反映體內(nèi)自由基清除能力的間接評(píng)價(jià)指標(biāo)[18]。而MDA是自由基作用于不飽和脂肪酸產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，通常作為機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度的指標(biāo)[19]。本試驗(yàn)中，加入不同質(zhì)量濃度潞黨參水提液后，根系中SOD活性均高于陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，MDA含量均顯著低于陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。這與黨參多糖可提高小鼠體內(nèi)SOD活性和降低MDA含量，實(shí)現(xiàn)抗氧化作用的結(jié)果相一致[20-21]。因此，不同質(zhì)量濃度潞黨參水提液對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的蠶豆根尖損傷具有一定的修復(fù)作用。當(dāng)潞黨參質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時(shí)，SOD活性最高，MDA含量最低。

綜上所述，不同質(zhì)量濃度的潞黨參水提液對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的蠶豆根尖損傷均具有一定的抗突變作用，且潞黨參水提液質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時(shí)，抗突變作用最好。有研究表明，活性化合物可以通過(guò)改變誘變劑對(duì)機(jī)體遺傳物質(zhì)的損傷而發(fā)揮抗突變作用[22]，因此，潞黨參的抗突變作用可能與潞黨參中的黨參多糖可提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用有關(guān)，具體作用機(jī)制還需要在后續(xù)的試驗(yàn)中進(jìn)行探討。