李元，王子戌，李淑艷，顧彤穎，林森， 聶小寶，黃寶生，張長峰*

(1.山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250103； 2.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250103； 3.國家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250103； 4.武漢理工大學(xué)，湖北 武漢 430070； 5.淮陰工學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

醉魚草BuddlejalindleyanaFortune屬馬錢科醉魚草屬植物，醉魚草屬植物約有100種，其分布廣泛，具有生長迅速、易栽培、易種植的特點(diǎn)，是天然中草藥[1]。中國古時就將其作為常用的中草藥廣泛應(yīng)用，具有祛風(fēng)殺蟲、活血功效，可治療跌打損傷、風(fēng)寒感冒、濕疹、皮膚瘙癢、蛔蟲、鉤蟲痛、風(fēng)濕麻木等疾病?！秵畏津?yàn)方調(diào)查資料選編》中記載，醉魚草五錢到一兩水煎服可治流行性感冒。在現(xiàn)代臨床應(yīng)用中也記載用復(fù)方醉魚草片劑，每次1片，日服3次，3～5 d后可緩解慢性支氣管炎。以上研究表明，醉魚草具有良好的醫(yī)用效果，在臨床應(yīng)用中也并未見對人類有損害的報(bào)道。關(guān)于醉魚草的化學(xué)成分，一般認(rèn)為主要有黃酮類、苯丙素酚苷類化合物、菇類、甾醇類等[2]。

目前，國內(nèi)關(guān)于醉魚草藥理作用的研究多為抗菌消炎方面的運(yùn)用及抑制腫瘤的作用[2]。《本草綱目》中對于醉魚草曾有“漁人采花及葉以毒魚，盡圍困而死”的記載。中國植物志記載：醉魚草全株有小毒，搗碎投入河中能使活魚麻醉，便于捕捉，故有“醉魚草”之稱。目前，關(guān)于醉魚草麻醉作用的科學(xué)研究尚未見報(bào)道。

活魚在運(yùn)輸過程中會不可避免地受到物理刺激和損傷，因此，在活魚運(yùn)輸中常使用麻醉劑，不僅能夠降低魚體新陳代謝，還可降低其對外界刺激的應(yīng)急反應(yīng)，減少在運(yùn)輸途中因碰撞、擠壓等對魚體造成的傷害[3]。目前，市面上使用最多的麻醉劑主要是MS-222、丁香酚。MS-222是目前唯一通過美國食品和藥物管理局(FDA)認(rèn)可使用的漁用麻醉劑，但FDA對使用MS-222麻醉劑有嚴(yán)格要求，在運(yùn)輸后需要有21 d的休藥期，等待藥物殘留消除后才可以在市場上銷售[4]。MS-222對水產(chǎn)品的麻醉作用見效快、安全性能高，經(jīng)其處理過的水產(chǎn)動物和人體接觸均無害，但價格較高。丁香酚是一種常見植物提取類麻醉劑，且丁香酚及其代謝產(chǎn)物能快速通過組織排泄出來，不會在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生有害物質(zhì)[5-6]，在食品中可直接添加，成本低廉，但丁香酚具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，藥效會隨著揮發(fā)過程逐漸減弱。因此，研發(fā)一種安全高效、廉價型的新型麻醉劑十分必要。Yoshida等[7]研究認(rèn)為，醉魚草對魚有毒性。鯽Carassiusauratus是中國的一種優(yōu)質(zhì)淡水經(jīng)濟(jì)魚類，本試驗(yàn)中，以鯽為試驗(yàn)對象，探究了醉魚草粗提物水溶液對鯽的麻醉效果，以及醉魚草對鯽血液生化指標(biāo)的影響，以期判斷其是否可作為安全的植物源麻醉劑，為活魚運(yùn)輸和魚用麻醉劑的研究提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用鯽購自山東省濟(jì)南市七里堡水產(chǎn)市場，選取體質(zhì)量和體長近似的鯽共30尾，平均體質(zhì)量為220 g左右，平均體長為22 cm左右，無疾病、無外傷。充氧后快速運(yùn)回山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，試驗(yàn)前暫養(yǎng)于水產(chǎn)品溫控蓄養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，從試驗(yàn)前一天至試驗(yàn)結(jié)束期間對鯽停止喂食。

醉魚草粗提物水溶液由醉魚草粗提物凍干粉加水混合均勻后配制而成。

1.2 方法

1.2.1 醉魚草粗提物凍干粉制備工藝

① 預(yù)處理。稱取一定量的醉魚草，用蒸餾水清洗，瀝干后，在65 ℃下烘干。

② 醉魚草提取液的制備。將預(yù)處理過的醉魚草放入粉碎機(jī)中，粉碎至40目左右,置入儲存罐中。按醉魚草粉與50%乙醇為1∶20的比例，將粉碎的醉魚草加入超聲循環(huán)提取機(jī)進(jìn)行超聲波提取。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為1000 r/min，超聲波頻率為40 kHz,溫度為30～50 ℃，提取120 min后，用300目的濾網(wǎng)將提取物原料殘?jiān)^濾出來。

③ 濃縮液的制備。將超聲提取液沉淀12 h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液至原體積的1/5左右。

④ 凍干粉的制備。將濃縮液裝入真空冷凍干燥機(jī)中，凍干12～24 h后，至冷阱冰量不再增加，終止，制得醉魚草粗提物凍干粉。

1.2.2 麻醉和復(fù)蘇階段行為特征觀察 由預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)醉魚草粗提物水溶液濃度達(dá)到 2 g/L 及以上時，鯽可達(dá)到麻醉的最終狀態(tài)。故此，隨機(jī)選取6尾鯽放入濃度為 2 g/L的醉魚草粗提物水溶液中，觀察并記錄魚體在麻醉和復(fù)蘇過程中各時期的行為特征。麻醉和復(fù)蘇分期參照劉長琳等[4]研究中確定的標(biāo)準(zhǔn)， 并結(jié)合鯽自身行為特征。

1.2.3 醉魚草粗提物水溶液對鯽的麻醉效果試驗(yàn) 試驗(yàn)在50 L水箱中進(jìn)行，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置2、4、6 g/L 3個醉魚草粗提物水溶液濃度組，每組6尾鯽，以3個濃度依次對鯽進(jìn)行麻醉試驗(yàn)，測定麻醉時間、復(fù)蘇時間及復(fù)蘇后的呼吸頻率，同時記錄鯽的復(fù)蘇率。將鯽進(jìn)入麻醉階段Ⅳ期所需的時間記為麻醉時間，進(jìn)入麻醉階段Ⅳ期的魚放入清水中后，恢復(fù)到正常游姿的時間記為復(fù)蘇時間[4]。

1.2.4 醉魚草粗提物水溶液(6 g/L)對鯽血清生化指標(biāo)的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)在50 L水箱中進(jìn)行，共使用12尾鯽。其中，3尾鯽作為對照組(麻醉前)，9尾鯽放入濃度為6 g/L的醉魚草粗提物水溶液中。失衡時(取最先失衡的鯽3尾)、復(fù)蘇0 h(取最先復(fù)蘇的鯽3尾)、復(fù)蘇12 h(取鯽3尾)3個階段取出鯽，采用斷尾法從鯽靜脈取血。將血液放入冰箱(4 ℃)靜置2 h后，4 ℃下以3500 r/min離心30 min制成血清，于冰箱(-80 ℃)中保存。

采用長春匯力生物技術(shù)有限公司相應(yīng)試劑盒分別測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH-L)活性；采用南京建成生物工程研究所相應(yīng)試劑盒測定過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit For Cortisol(武漢優(yōu)爾生生命科學(xué)裝備有限公司)測定皮質(zhì)醇(COR)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽麻醉和復(fù)蘇階段的行為特征

在醉魚草粗提物水溶液質(zhì)量濃度為2 g/L時，觀察鯽的麻醉和復(fù)蘇行為特征。從表1可見：麻醉Ⅰ期的鯽對醉魚草粗提物水溶液的初接觸反應(yīng)較為激烈，進(jìn)入Ⅱ期后反應(yīng)衰退；在麻醉的各個階段，鯽的呼吸頻率產(chǎn)生不同的變化，Ⅰ期時鯽呼吸頻率加快，而Ⅱ期到Ⅳ期時鯽呼吸頻率低于正常期，Ⅴ期鯽呼吸近乎停止；在復(fù)蘇階段，鯽的呼吸頻率則不斷增加，在復(fù)蘇Ⅳ期完全恢復(fù)。

表1 鯽麻醉和復(fù)蘇階段的行為特征(醉魚草水溶液濃度2 g/L)

2.2 醉魚草粗提物水溶液對鯽的麻醉效果

從表2可見：醉魚草水溶液濃度為6 g/L時鯽的平均麻醉時間是2 g/L濃度時的81%，復(fù)蘇后平均呼吸頻率較2 g/L濃度時下降10次/min，而平均復(fù)蘇時間是2 g/L濃度時的200%；3個濃度組鯽復(fù)蘇率均為100%，表明在2～6 g/L濃度范圍內(nèi)短時間內(nèi)藥浴，對魚體相對安全。從表2還可見，隨著醉魚草水溶液濃度提高，在相近體質(zhì)量與體長的鯽試驗(yàn)中，鯽被麻醉的時間減少，鯽復(fù)蘇后平均呼吸頻率越低，復(fù)蘇所需時間越長。以市場應(yīng)用為出發(fā)點(diǎn)，平均麻醉時間短更是市場需求的重點(diǎn)，可見，試驗(yàn)濃度為6 g/L時麻醉效率更高。

表2 醉魚草水溶液對鯽的麻醉效果Tab.2 Anaesthetic effects of aqueous solution of Buddleja lindleyana on crucian carp Carassius auratus

2.3 醉魚草粗提物水溶液對鯽血清生化指標(biāo)的影響

魚類的血清生理生化指標(biāo)與機(jī)體的代謝、營養(yǎng)狀況及疾病有著密切的關(guān)系， 當(dāng)魚體受到外界因子的影響而發(fā)生生理或病理變化時，必定會在血液指標(biāo)中反映出來。

從表3可見：醉魚草水溶液對鯽麻醉前后，鯽血液ALT、AST、LDH-L、CAT、COR、ALP、SOD含量均有顯著性差異(P<0.05)；ALT活力從鯽失衡至復(fù)蘇后0 h持續(xù)下降且始終顯著低于麻醉前(P<0.05)；AST活力在藥浴后則持續(xù)升高，失衡后始終顯著高于麻醉前(P<0.05)；LDH-L活力失衡時顯著增加(P<0.05)，之后持續(xù)下降且顯著低于麻醉前(P<0.05)；ALP、CAT活力失衡時顯著增加(P<0.05)，復(fù)蘇后0 h下降，此時ALP、CAT活力顯著低于麻醉前(未麻醉狀態(tài))(P<0.05)；COR含量和SOD活力從鯽失衡時開始下降，復(fù)蘇12 h后上升，復(fù)蘇12 h時COR和SOD水平均接近麻醉前。

表3 醉魚草水溶液對鯽血清生化指標(biāo)的影響

2.4 醉魚草提取物的安全性評價

根據(jù)《GB 15193.3—2014食品安全毒理學(xué)評價程序和方法》對醉魚草提取物進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，選取ICR小鼠20只，雌雄各半，清潔級，由浙江省試驗(yàn)動物中心提供。稱取10.0666 g醉魚草提取物置于燒杯中，取少量純水將樣品混勻后倒入20 mL容量瓶內(nèi)，加入純水定容至刻度線。采用最大限量法，灌胃劑量為10066.6 μg/kg， 對動物用經(jīng)口灌胃法一次染毒，染毒后繼續(xù)禁食1 h，觀察并記錄染毒過程和觀察期內(nèi)動物的中毒和死亡情況，觀察周期14 d，觀察結(jié)束后對存活動物進(jìn)行解剖。試驗(yàn)動物在14 d內(nèi)未出現(xiàn)中毒癥狀和中毒死亡，對受試動物解剖觀察，其內(nèi)臟未發(fā)現(xiàn)異常變化，且LD50>10066.6 mg/kg，根據(jù)《GB 15193.3—2014食品安全毒理學(xué)評價程序和方法》急性毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，該樣品急性經(jīng)口LD50>5000 mg/kg，由此判定，該提取物屬于實(shí)際無毒性。

3 討論

3.1 醉魚草對鯽的麻醉效果

本研究表明，醉魚草粗提物水溶液對鯽確有麻醉作用，在麻醉效果測試中，大多數(shù)鯽隨著藥液濃度的增加產(chǎn)生麻醉作用的時間縮短，復(fù)蘇時間增加。這與丁香酚對鯽的麻醉效果相似[8]，但與丁香酚對羅非魚的麻醉效果有所不同，如丁香酚對羅非魚的麻醉則是復(fù)蘇時間隨著濃度的提高而縮短[9]。因此，醉魚草粗提物水溶液對鯽麻醉效果明顯。

3.2 醉魚草對鯽血清生化指標(biāo)的影響

ALT和AST是兩種最重要的轉(zhuǎn)氨酶，ALT是肝細(xì)胞損傷最敏感、最特異的指標(biāo)，ALT升高常反映肝功能發(fā)生障礙；AST含量在心肌細(xì)胞中最多，其含量顯著增加常預(yù)示心肌細(xì)胞可能受到一定程度的損傷[10]。本試驗(yàn)中，ALT活力未見升高；AST活力則在藥浴后持續(xù)升高，失衡后始終顯著高于麻醉前。由此表明，醉魚草水溶液可能損傷了鯽的心肌細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)的AST釋放，故其在血清中的濃度升高。

LDH是一種分布于所有組織細(xì)胞胞漿中的糖酵解酶，是用于診斷心肌損傷的主要生化指標(biāo)[11]。本試驗(yàn)中，麻醉后LDH-L活力先升高后又下降，復(fù)蘇后12 h鯽的LDH-L活力下降明顯。劇烈運(yùn)動能夠使細(xì)胞通透性發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶逸出進(jìn)入細(xì)胞外液，引起血清乳酸脫氫酶升高，使骨骼肌無氧代謝能力降低，乳酸堆積而引起疲勞。因此，LDH-L先升高再下降的變化趨勢也說明鯽經(jīng)過前期應(yīng)激反應(yīng)后，變得更加穩(wěn)定。

磷酸酶對于動物體內(nèi)的解毒體系有著重要的作用[12]。ALP是動物代謝的重要調(diào)節(jié)因子和非特異性磷酸酶，在水生動物體內(nèi)鈣的吸收、磷酸鈣的形成中起著重要的作用，是水生動物生長和生存的重要酶之一[13-14]。本試驗(yàn)中，復(fù)蘇后0 h鯽的ALP活力顯著低于麻醉前(未麻醉狀態(tài))，說明醉魚草水溶液含有抑制ALP的活性成分，在復(fù)蘇后12 h ALP活力基本恢復(fù)到未麻醉時的水平，這表明醉魚草對鯽ALP的長期影響較小。

CAT和SOD在清理生理過程中產(chǎn)生的過氧化物方面有較重要作用，是水生生物抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成成分，可以減少細(xì)胞損傷[15]。本試驗(yàn)中，復(fù)蘇后0 h鯽的 SOD活力顯著下降，但復(fù)蘇后12 h鯽的 CAT活力顯著升高，且恢復(fù)到麻醉前狀態(tài)。CAT、SOD酶活性的變化能在一定程度上反映機(jī)體在環(huán)境脅迫下免疫機(jī)能的變化。本研究表明，醉魚草水溶液可能使鯽在麻醉過程中產(chǎn)生了免疫機(jī)能的變化，鯽CAT的顯著升高也表明激發(fā)了肝細(xì)胞的氧化防御反應(yīng)，細(xì)胞通過提高CAT來抵御物質(zhì)帶來的氧化損傷。

COR濃度一般被作為魚壓力變化的指標(biāo)，COR在血清中的水平是魚體應(yīng)激的一項(xiàng)重要指標(biāo)[16]。本試驗(yàn)中，麻醉后COR濃度始終低于麻醉前的水平，說明醉魚草水溶液對魚的壓力刺激較小，且能夠確保維持鎮(zhèn)靜效果。

3.3 醉魚草的使用前景

一般認(rèn)為，理想的麻醉濃度為3 min內(nèi)麻醉，5 min內(nèi)蘇醒[17]。本研究中，濃度為2、4、6 g/L的醉魚草粗提物水溶液對鯽進(jìn)行的平均麻醉時間分別為22.2、19.7、18.0 min，麻醉后平均復(fù)蘇時間分別為0.8、1.1、1.6 min，表明醉魚草水溶液的麻醉時間尚未達(dá)到理想麻醉的標(biāo)準(zhǔn)，可能與本試驗(yàn)中設(shè)置的醉魚草水溶液濃度較低有關(guān)。目前，學(xué)界對醉魚草有效成分藥用價值的研究有待完善，本研究結(jié)果有助于開發(fā)一種安全性高、價格低廉的新型魚用麻醉劑，并為水產(chǎn)品現(xiàn)代物流技術(shù)體系提供強(qiáng)有力支撐，解決運(yùn)輸中成活率低的問題，降低運(yùn)輸風(fēng)險與成本，保障消費(fèi)者安全食用水產(chǎn)品。