欒雨婷，蔡文君，蔣軾麗，趙長青，顧宏圖，袁繼麗，邢 楓，呂 靖，劉成海，劉 平，慕永平

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所，教育部肝腎疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

在我國，60%以上的肝硬化由HBV感染引起[1-2]。近年來，“腸-肝軸”受到廣泛關(guān)注，人體腸道微生物大約有4萬余種，可分為擬桿菌門和厚壁菌門兩大類，它們在人體健康和疾病中發(fā)揮重要作用[3-4]。目前已明確腸道菌群與酒精性肝病、自身免疫性肝病、慢性乙型肝炎和肝硬化等關(guān)系密切，腸道菌群紊亂可促進(jìn)肝臟疾病的進(jìn)展[5-7]。

腹水是肝硬化患者最常見的并發(fā)癥，約50%的患者在診斷后10年內(nèi)出現(xiàn)腹水。失代償期肝硬化合并腹水的患者1年和2年生存率分別為60%和45%[8-9]。此外，在肝硬化腹水的住院患者中，自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis, SBP)的發(fā)病率為10%～30%，病死率為30%～50%[10-11]。細(xì)菌易位是肝硬化腹水患者發(fā)生SBP的關(guān)鍵機(jī)制[12-16]。雖然腸道菌群與肝硬化的進(jìn)展密切相關(guān)[17-18]，但目前尚不清楚無SBP的乙型肝炎肝硬化(hepatitis B liver cirrhosis, HBLC)伴有腹水患者(HBLC with ascites,HBLC-WA)與乙型肝炎肝硬化無腹水患者(HBLC without ascites, HBLC-WOA)腸道菌群的差異。本研究采用16S rRNA測序技術(shù)，比較分析了HBLC-WOA與HBLC-WA(無SBP)患者的腸道菌群特征。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2016年10月-12月于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝硬化科就診的60例HBLC患者的糞便樣本，包括30例HBLC-WOA患者和30例HBLC-WA但無SBP患者。同時(shí)還收集了30例健康人群(HC)的糞便樣本。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)HBV感染史>6個(gè)月；(2)HBsAg陽性；(3)B超、CT、MRI或肝活檢診斷為HBLC；(4)接受恩替卡韋治療且HBV DNA陰性。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)伴有SBP者；(2)在過去1個(gè)月內(nèi)接受抗生素、激素、免疫抑制劑或化療藥物者；(3)伴HCV感染、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎或其他原因的肝硬化患者；(4)因癌癥、腎源性、心源性、結(jié)核病或其他原因的腹水患者；(5)有心血管疾病、糖尿病、腸道炎癥性疾病、嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、精神疾病或其他疾病的患者；(6)目前服用微生物制劑、酸奶或其他益生菌者。

1.4 糞便樣本收集和DNA提取 于早晨空腹采集糞便樣本(約3 g/人)，置于無菌塑料杯中，1 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于細(xì)菌基因組DNA提取。

1.5 糞便微生物DNA提取、鑒定以及16S rRNA測序及數(shù)據(jù)處理 由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。糞便微生物DNA抽提采用E.Z.N.A.? Stool DNA Kit(Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA)，DNA濃度和純度采用NanoDrop 2000UV-Vis分光光度計(jì)(Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA)測定。DNA質(zhì)量采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用熱循環(huán)PCR系統(tǒng)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4超變區(qū)，引物序列為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，獲取的PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用AXYGEN公司提供的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收，Tris_HCl洗脫，定量，Illumina PE250/PE300測序(每個(gè)糞便標(biāo)本至少完成2萬條測序數(shù)據(jù))，完成生物信息分析。

1.6 臨床試驗(yàn)注冊 本研究已經(jīng)在中國臨床試驗(yàn)注冊網(wǎng)站上注冊(注冊號：ChiCTR-ROC-16009630)。

1.7 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)上海中醫(yī)大學(xué)附屬曙光醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批號：2016-kykt-07)。所有參與者均知曉有關(guān)研究信息，并簽署了書面知情同意書。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析采用R包(V.2.15.3)和SPSS21.0軟件。非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用M(P25～P75)表示，2組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；3組比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料2 組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。組間各物種相對豐度差異的比較采用多重假設(shè)檢驗(yàn)，采用Benjamini 和Hochberg 錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(fdr)進(jìn)行調(diào)整，Pfdr<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。不同條件下組間的差異比較采用相似性分析(ANOSIM)和非參數(shù)多元方差分析(Adonis)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 根據(jù)糞便樣本質(zhì)量鑒定結(jié)果，最終HBLC-WOA組納入30例，HBLC-WA組納入 27例，HC組納入28例。HBLC患者基線特征見表1。HC組男10例，女18例，平均53(44～58)歲，BMI為23.28(22.37～24.87)kg/m2。

2.2 HBLC患者糞便微生物的總體構(gòu)成變化 所有85個(gè)樣本，共生成3 750 652個(gè)有效序列進(jìn)行下游分析，所有樣本平均值為439.39 bp。物種豐富度和多樣性指數(shù)見表2。采用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分析腸道微生物的α多樣性，結(jié)果表明伴隨著腹水的出現(xiàn)，與HC組比較，HBLC-WA組Shannon指數(shù)顯著下降(P=0.042)，提示腸道微生物的多樣性下降。ACE和Chao1指數(shù)在3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。主坐標(biāo)分析(PCoA)顯示，HBLC-WOA組、HBLC-WA組與HC組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HBLC-WOA vs HC ANOSIM:R=0.159,P=0.001, Adonis:R2=0.067,P=0.001; HBLC-WA vs HC, ANOSIM:R=0.323,P=0.001, Adonis:R2=0.107,P=0.001)(圖1)。

2.3 HBLC-WOA和HBLC-WA患者糞便微生物群的特征 為考察糞便樣品中微生物的特定菌群的變化，門水平上，分析了占總DNA序列> 0.1% 的菌群相對豐度。結(jié)果顯示，與HBLC-WOA組和HC組比較，HBLC-WA組變形菌門豐度顯著增加(Pfdr值分別<0.01、<0.001)(圖 2a～b)。

在屬水平上，將總DNA>1%者定義為優(yōu)勢菌屬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBLC-WA組硬壁菌門的罕見小球菌屬(Subdoligranulum)和假丁弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)的豐度降低，均顯著低于HC組(P值分別<0.01、<0.001)。而變形菌門的腸桿菌屬(Enterobacter)和大腸埃希菌屬(Escherichia-Shigella)，以及硬壁菌門的韋榮球菌屬(Veillonella)的豐度均隨著腹水的出現(xiàn)而升高，且在HBLC-WA組顯著高于HC組(P值分別為<0.05、<0.001、<0.01)(圖2c)。

表1 HBLC患者基線特征比較

表2 16S r RNA基因文庫的生物種系覆蓋和多樣性對比

2.4 特定菌屬與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性分析 采用Spearman秩檢驗(yàn)，考察了屬水平上10個(gè)細(xì)菌分類與臨床變量之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，大腸埃希菌屬和韋榮球菌屬均與CTP評分(P值均< 0.01)、PT(P值均<0.05)和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)(P值均<0.05)呈正相關(guān)，與Alb水平呈負(fù)相關(guān)(P值分別為<0.001、<0.05)。假丁弧菌、norank_f_毛螺菌科、unclassified_f_毛螺菌科、布勞特氏菌屬與Alb水平呈正相關(guān)(P值分別為<0.01、<0.05、<0.01、<0.05)，與CTP評分(P值分別為<0.001、<0.01、<0.05、<0.05)和CRP(P值分別<0.01、<0.05、<0.05、<0.01)均呈負(fù)相關(guān)(圖3)。

2.5 HBLC-WOA和HBLC-WA患者腸道微生物群功能變化 進(jìn)一步探討HBLC患者腸道微生物群的功能改變，使用PICRUSt生物信息軟件包預(yù)測了糞便微生物群。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)(level 3)分類顯示，隨著腹水的出現(xiàn)，與轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白、α-亞油酸代謝、金黃色葡萄球菌感染和細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞等相關(guān)通路菌群的豐度逐漸增加(Pfdr值均<0.05)，而類黃酮生物合成通路的菌群豐度逐漸降低(Pfdr<0.05)(圖4)。

為進(jìn)一步了解HBLC患者糞便特定菌屬的功能，采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)分析了特定菌屬與KEGG通路所預(yù)測的差異表達(dá)之間的相關(guān)性。在調(diào)整年齡、性別和BMI之后，發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬和大腸埃希菌屬與許多疾病有關(guān)，而假丁弧菌屬和罕見小球菌屬與黃酮類生物合成通路相關(guān)(r=0.428,r=0.455,P值均<0.001)。尤其是大腸埃希菌屬與細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞通路相關(guān)(r=0.891,P<0.001)，腸桿菌屬與膽汁分泌通路相關(guān)(r=1.000,P<0.001)。由于大腸埃希氏菌屬和腸桿菌同屬腸桿菌科，在OTU水平上進(jìn)一步研究了這兩個(gè)屬，發(fā)現(xiàn)OTU318(0.11%)、OTU434(7.51%)、OTU367(21.49%)和 OTU230(67.18%)在腸桿菌科的序列中占96.29%以上，Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)表明檢驗(yàn)表明，OTU230與細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞通路呈正相關(guān)(r=0.891,P<0.001)；OTU434和 OTU367與膽汁分泌通路呈正相關(guān)(r=0.676,P<0.001和r=0.773,P<0.001)(圖5)。提示腸桿菌科家族參與肝硬化患者細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞和膽汁分泌通路，可能與HBLC-WA的進(jìn)展密切相關(guān)。

3 討論

人類腸道的所有微生物統(tǒng)稱為“腸道微生物群”。腸道微生物群的改變在HBV相關(guān)慢性肝病的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[19]。人類腸道微生物主要由擬桿菌門和變形菌門構(gòu)成[20]，Lu等[21]報(bào)道了HBLC患者糞便微生物群的多樣性明顯降低。并發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門的比例明顯降低，而變形菌門和梭桿菌門的比例在肝硬化患者中高度富集。在科水平上，腸桿菌科、鏈球菌科和韋榮球菌科的豐度大于HC人群；而乳酸菌科、雙歧桿菌科和糞桿菌科則減少[17,22-24]。

本研究結(jié)果表明，HBLC患者隨著腹水的出現(xiàn)，與HC組和HBLC-WOA組患者相比，HBLC-WA組患者的變形菌門豐度顯著增加，提示變形菌門在HBLC-WA患者中可能發(fā)揮更重要的作用。

在屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)與HBLC-WOA組比較，HBLC-WA組中硬壁菌門的罕見小球菌屬和假丁弧菌屬豐度顯著降低，而變形菌門的腸桿菌屬和大腸埃希菌屬以及硬壁菌門的韋榮球菌屬豐度顯著增加，提示腸桿菌屬、大腸埃希菌屬和韋榮球菌屬可能對預(yù)測HBLC-WA患者SBP的發(fā)生具有重要作用。

關(guān)于糞便微生物與肝功能的關(guān)系，Wei 等[25]報(bào)道HBLC患者的CTP評分與擬桿菌門豐度負(fù)相關(guān)，而與腸桿菌科和韋榮球菌屬豐度正相關(guān)。本研究中，除了證實(shí)HBLC患者的大腸埃希菌屬(屬腸桿菌科)和韋榮球菌屬的豐度與CTP評分正相關(guān)之外，還發(fā)現(xiàn)它們與PT和 INR正相關(guān)，而與Alb水平負(fù)相關(guān)。并且還發(fā)現(xiàn)假丁弧菌與CTP評分負(fù)相關(guān)，而與Alb水平正相關(guān)。提示盡管在HBLC-WA患者沒有明確的SBP證據(jù)，但腸道微生物群中的潛在致病細(xì)菌卻已增加，有益菌則明顯減少，而HBLC患者腸道內(nèi)過度生長的特定細(xì)菌種群與肝功能障礙的嚴(yán)重程度有關(guān)[24,26]。因此，腸道菌群失調(diào)可能對肝硬化患者的預(yù)后具有重要意義，或至少隨著肝臟疾病的進(jìn)展而演變[17,27]。

肝臟是一個(gè)重要的免疫器官，是第一個(gè)攔截腸道來源細(xì)菌的器官，從而形成一道防火墻以清除循環(huán)入侵的細(xì)菌[28]。肝硬化患者隨著肝功能的惡化，腸壁通透性增加，導(dǎo)致細(xì)菌及其產(chǎn)物進(jìn)入血液并引發(fā)全身的炎癥反應(yīng)，這種腸-肝軸紊亂是肝病并發(fā)癥的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[29]。在原發(fā)性膽汁性膽管炎中，上皮細(xì)胞細(xì)菌侵入通路與腸桿菌科細(xì)菌的豐度高度相關(guān)[30]，而HBLC患者糞便微生物中谷胱甘肽、糖原異生、支鏈氨基酸、氮和脂質(zhì)代謝等通路水平上調(diào)，但芳香氨基酸、膽汁酸和細(xì)胞周期相關(guān)通路水平下降[25]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)HBLC-WA患者腸桿菌科的腸桿菌屬和大腸埃希菌屬的豐度顯著增加。且大腸埃希氏菌屬與細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞通路呈正相關(guān)，腸桿菌屬與膽汁分泌通路呈正相關(guān)。因此，腸桿菌科可能參與HBLC-WA患者的腸道通透性增加和膽汁酸的重吸收，促進(jìn)肝硬化的進(jìn)展。

綜上所述，腸道微生物群在宿主代謝和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[31]，肝臟是與腸道接觸最密切的器官，暴露于大量的細(xì)菌成分及其代謝物中[32]。HBLC-WA患者腸桿菌屬和大腸埃希菌屬的豐度顯著增加，兩者均與臨床指標(biāo)、細(xì)菌易位、膽汁代謝顯著相關(guān)。因此，即使HBLC-WA患者未合并典型的SBP，預(yù)防性抗感染治療可能是需要的。當(dāng)然，肝硬化程度與腸道菌群異常之間可能相互影響，仍需要進(jìn)一步的研究。