王瑞珍，溫韋華，劉浡洋，崔 夏，賀 然，曲良建，張永安

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所,國家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2.北京市植物園/北京市花卉園藝工程技術(shù)研究中心，北京 100093；3.中國林業(yè)科學(xué)研究院華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100000)

松材線蟲?。˙ursaphelenchus xylophilus）是全球公認(rèn)的檢疫性有害生物，是松樹最大威脅，曾給亞洲和歐洲等部分國家或地區(qū)造成了毀滅性生態(tài)損害和顯著經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。目前，我國對松材線蟲的防治手段主要有化學(xué)防治、物理防治、生物防治等，但仍以化學(xué)防治為主，如使用化學(xué)藥劑久效磷、甲胺磷、阿維菌素等進(jìn)行點(diǎn)滴注干。雖然該方法可以取得較好的防治效果，但長期使用，易對環(huán)境造成危害，而且易使線蟲產(chǎn)生抗藥性[3]。在國際上，還未見有對松材線蟲進(jìn)行直接大規(guī)模生物防治的實(shí)例，因此，對松材線蟲開展生物防治還需要加快深入研究[4]。

伊氏殺線真菌（Esteya vermicola，EV）屬于食線蟲真菌，是松材線蟲的內(nèi)寄生真菌，它產(chǎn)生的新月形孢子能夠在短時間內(nèi)侵染并殺死松材線蟲。因其對松材線蟲具有高感染性和較強(qiáng)致死性，該菌有潛力成為生防菌株[5-7]。若EV 菌成為共生真菌共存于松樹體內(nèi)，則有望更高效地防治松樹松材線蟲。本試驗(yàn)通過一組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，測試適宜EV 真菌生長的pH 范圍，研究EV 菌在加有松樹不同部位材料的培養(yǎng)基上的生長繁殖情況，探討EV 菌在松樹體內(nèi)定殖的可能性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

Esteya vermicola CBS115803 （EV115803）和CNU120806 （EV120806）。分別購于荷蘭微生物菌種保藏中心和韓國微生物保存中心。

1.2 培養(yǎng)基的配制

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（美國BD 公司），按照說明書每升水加入24 g 培養(yǎng)基和10 g 瓊脂。121 ℃高溫高壓滅菌20 min。將剛經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基冷卻至40 ～50 ℃，加入相應(yīng)量的濃鹽酸和10M NaOH，將培養(yǎng)基pH 值分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，后倒平板。待平板凝固后，在平板中央接種新鮮EV 菌餅（直徑5 mm），置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每個pH 處理重復(fù)3 次。

WA 培養(yǎng)基：每升蒸餾水中加入10 g 瓊脂，后經(jīng)高壓滅菌。

黑松（Pinus thunbergii Parl.）材料于2014 年采自中國林科院（北京）院內(nèi)，樹齡約35 a，選取1～5 年生新鮮小松枝及松針，分為松針、松樹皮、松針附著的小松枝和木質(zhì)部4 個部分，用小型粉碎機(jī)粉碎，獲得松針粉末（Y）、松樹皮粉末（P）、松針附著的小松枝粉末（Z）和木質(zhì)部的鋸末（J）。

將4 種松樹成分分別加入到PDA 和WA 這兩種培養(yǎng)基中，按50 mL 的培養(yǎng)基分別添加5 g 的Y、P、Z、J（質(zhì)量與體積比為10%）比例，配制成PDA+Y、PDA+P、PDA+Z、PDA+J、WA+Y、WA+P、WA+Z、WA+J 8 種培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基PDA 和WA 均為自然pH 值，pH 值為6.5 左右。121 ℃滅菌20 min，制成含松樹基質(zhì)的培養(yǎng)基。分別接種EV115803 和EV120806 活菌菌餅（直徑5 mm），置于25 ℃培養(yǎng)，每天觀察和測量菌落的生長情況。

1.3 顯微形態(tài)觀察

在加有不同松樹部位材料的培養(yǎng)基上生長15 d的菌落邊緣打取3 個菌餅，放入1 mL 蒸餾水中，震蕩10 min，獲得孢子懸浮液，在光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用ANOVA 進(jìn)行方差分析，并利用F-test 檢驗(yàn)各個主因素及交互的顯著性。若主因素及交互作用不顯著，則將其剔除并重新分析。所有分析及繪圖均在R 中完成（版本號3.5.0）。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 值對EV 菌生長的影響

通過觀察和測定EV 菌在不同pH 值培養(yǎng)基上的菌落生長情況，發(fā)現(xiàn)兩株EV 真菌在pH5～13 培養(yǎng)基上均可生長，但在pH≤4 的平板（瓊脂不凝固）上不能生長。這兩株EV 菌生長速度存在明顯差異（圖1）。由圖1 可看出，在pH 5～8 平板上，菌株EV115803 菌落直徑均大于EV120806 菌落直徑。在pH 5～7 時，兩菌株菌落直徑均差異顯著。在pH 9～13 時，EV120806 菌落直徑均大于EV115803菌落直徑，但只在pH 10 時EV115803 和EV120806菌落差異顯著。同株菌株比較，菌株EV115803 在pH 7 時菌落直徑最大，菌絲的延伸速度最快。而EV120806 在pH 10 菌落直徑最大，菌絲生長速度最快。當(dāng)pH 值＞7 時，隨pH 值的增加，兩株EV菌菌落顏色逐漸變淺，氣生菌絲菌體量少于酸性條件下的菌體量（圖2）。

2.2 PDA 中添加松樹成分對EV 菌生長的影響

圖1 pH 對EV 菌株生長的影響Fig.1 Effect of pH on growth of EV strains

圖2 兩株菌在不同pH 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony of two strains at PDA with different pH values

在培養(yǎng)至3 d 時，與PDA 對照相比，菌株EV 115803 和EV120806 在PDA+Y、PDA+P、PDA+Z上氣生菌絲體發(fā)達(dá)茂盛，但在PDA+J 培養(yǎng)基上兩個菌株則未見生長。當(dāng)培養(yǎng)至5 d 時，EV115803和EV120806 在PDA+J 上才見菌體生長。在PDA+J 上，EV120806 較EV115803 生長的快，前者幾乎是后者的兩倍。當(dāng)培養(yǎng)至7 d、11 d 和15 d 時，菌株EV115803 在PDA 上菌落直徑分別達(dá)到3.7 cm、6.2 cm、8.3 cm。菌株EV115803 在PDA+P、PDA+Z、PDA+Y 和PDA+J 上生長較慢，其中在PDA+J 上的菌落生長速度最慢（圖3 上）。菌株EV120806表現(xiàn)不同，除對照PDA 外，該菌在PDA+Z 上菌絲生長速度最快。值得關(guān)注的是，在7 d 時，菌株EV120806 在PDA+J 上的生長速度顯著高于EV11 5803，在11 d 和15 d 時亦是如此（圖3 下）。

圖3 在PDA 上添加松樹成分對EV 菌絲體生長的影響Fig.3 Effects of adding pine nutrients in PDA medium on mycelial growth of EV strains

從圖4 可以看出，在PDA 中添加松樹成分，均可促進(jìn)兩個菌株的菌落生長，氣生菌絲發(fā)達(dá)，濃密。在PDA 上，添加松樹成份更易促進(jìn)菌株EV120806 生 長。生 長 至30 d 時，EV120806 在PDA+J 上的菌落直徑為8.9 cm（長滿整個平板），而EV115803 在PDA+J 上的菌落直徑才6.8 cm。菌株EV120806 產(chǎn)生彎月狀孢子的數(shù)量（15 d 觀察時極少有桿狀孢子）也多于菌株EV115803（圖片未顯示）。

2.3 WA 中添加松樹成分對EV 菌生長的影響

圖4 PDA 上添加不同松樹成分對EV 菌落形態(tài)的影響（15 d）Fig.4 Effect of adding pine nutrients in PDA medium on colony morphology of EV (15 d)

菌株EV115803 和EV120806 在WA+Y、WA+P、WA+Z 上氣生菌絲發(fā)達(dá)茂盛，但與PDA+上生長相比，其菌落稀疏。對EV115803 菌株來講（圖5上），在15 d 時，在WA+P 上生長的菌落直徑最大；對于EV120806 菌株來講，在15 d 時，在WA+Y 上生長的菌落直徑最大。當(dāng)兩株真菌在培養(yǎng)至7 d、11 d 和15 d 時，EV120806 菌株在WA、WA+J、WA+P、WA+Y 和WA+Z 上的菌落生長速度均大于EV115803 菌株（圖5 下）。

從生長數(shù)據(jù)和菌落形態(tài)看（圖5 和圖6），2 個菌株對松針、枝條和樹皮（WA+Y 和WA+Z、WA+P）的適應(yīng)能力強(qiáng)，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲生長速度快。在WA+J（木質(zhì)部鋸末）上生長較慢。生長至30 d，EV120806 在WA+J 上的菌落直徑為6.0 cm，而EV115803 在WA+J 上的菌落直徑僅為4.7 cm。

圖5 WA 培養(yǎng)基上填加不同松樹成分對EV 菌落生長的影響Fig.5 Effect of adding different pine nutrient in WA medium on EV colony growth

圖6 WA 培養(yǎng)基上添加松樹成分對EV 菌落形態(tài)的影響（15 d）Fig.6 Effect of adding pin nutrients in WA medium on colony morphology of EV strains (15 d)

3 討論

通過配制不同pH 值的培養(yǎng)基試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)供試2 株EV 菌株的最適pH 不同。2 株EV 菌可以生長的的pH 值范圍很廣（5～13），且在酸性條件下產(chǎn)生更多的氣生菌絲。通過添加松樹不同部位成份試驗(yàn)，在有外源營養(yǎng)的條件下，如在PDA 上添加松針、松樹皮、松樹枝條和木質(zhì)部鋸末對EV 菌生長均具有一定的刺激作用，表現(xiàn)為氣生菌絲茂盛，單位面積的菌體量增多。當(dāng)在WA 上添加松針、松樹皮、松樹枝條成分時，2 株EV 菌也能茂盛生長，但以木質(zhì)部鋸末為單一營養(yǎng)源時EV 菌則生長緩慢。

3.1 EV 菌是一種很強(qiáng)的耐堿微生物

在EV 菌細(xì)胞內(nèi)存在假單孢屬的共生細(xì)菌[5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，許多真菌具有較寬的pH 生長范圍（如pH 4～11）[8]。食線蟲真菌Duddingtonia flagrans在pH＜13 的堿性條件下均可以生長[9]。近緣毛殼菌（Chaetomium subaffine）生防菌株可以在pH 13 時仍可生長[10]。非嗜極細(xì)菌可生長的pH 范圍為5.5～9.0[11]，專性嗜堿微生物可在pH 11～12 的條件下生長，但在中性pH 條件下卻不能生長。例如，巴氏芽孢桿菌 (Bacillus pasturii)、嗜堿芽孢桿菌 (B.alcalophilus)等細(xì)菌。一種黃桿菌 (Flavobacterium)能在 pH 11.4 的條件下生長[10]。而EV 菌能在pH 13 的條件下生長，說明其耐堿性極強(qiáng)，可能與其細(xì)胞內(nèi)存在的細(xì)菌有關(guān)。

3.2 EV 菌能否作為共生菌在松樹體內(nèi)定殖？

目前，在全球范圍共分離出6 株EV 菌（CBS 156.82、CBS 100821、ATCC 74485、CBS 115803、CNU 120806、NKF 132229）[11-13]，有2 株（CBS 156.82 和ATCC 74485）是從松樹（Pinus sp.，P.thunbergii Parl.）中分離到的。盡管本研究所選用的2 株EV 菌的原始分離基質(zhì)不是松屬植物，如EV115803 是從橡樹中分離到的，而EV120806 是從松林的土壤中分離到的，二者可在添加有松樹成分的培養(yǎng)基上生長，對氣生菌絲生長有刺激作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，EV 菌可耐受松樹的抗菌物質(zhì)，如松脂等。松樹木質(zhì)部鋸末中的主要成分是木質(zhì)素和纖維素，EV 菌也可以在松樹木質(zhì)部鋸末中生長，雖然生長速度顯著低于松針、樹皮和松枝，作者推測可能是由于鋸末（木質(zhì)部成分）中的松脂含量高，或是需要合成一些降解木質(zhì)素或者纖維素的酶，需要較長時間調(diào)整代謝所致。許多研究表明，將生防真菌（如昆蟲病原真菌）引入植物中作為共生真菌，以此產(chǎn)生抗菌作用或是對昆蟲的攝食產(chǎn)生威懾作用是可行的[14]。目前，已經(jīng)報(bào)道的作為植物共生菌的生防真菌有Beauveria bassiana[15-20]，Clado-sporium spp.[21]，Lecanicillium dimorphum[22]等。因此，未來有望將EV 菌定殖在松樹中做為共生菌，攝食入侵的松材線蟲，從而使松樹具有內(nèi)源的防控因子，對松材線蟲起到防控作用。

3.3 EV 菌不同培養(yǎng)對孢子產(chǎn)生的影響

據(jù)作者初步觀察，EV 菌在PDA 上生長后期（如15 天后），在菌落中央會產(chǎn)生大量的白色粉狀的桿狀孢子，菌落中央顏色較邊緣淺，EV115803 更易產(chǎn)生桿狀孢子。在PDA 上添加松樹成分，可以促進(jìn)EV 菌氣生菌絲體生長，而且促進(jìn)彎月狀孢子生長，其中以菌株EV120806 最為明顯。相比EV115803，EV120806 或許是一個較好的菌株，有待進(jìn)一步試驗(yàn)。我們推測，松樹中的某種成分可能誘導(dǎo)EV 菌彎月形孢子大量產(chǎn)生。

4 結(jié)論

通過pH 和以松樹不同部位為培養(yǎng)基的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)EV 菌適應(yīng)的pH 值范圍為5～13，EV 菌耐堿性極強(qiáng)，且EV 菌在加有松樹各部位成分的培養(yǎng)基上均能夠生長，相比EV115803，菌株EV120806對松樹培養(yǎng)基的適應(yīng)性更強(qiáng)，未來有望將EV 菌定殖在松樹中做為共生菌，攝食入侵的松材線蟲，從而使松樹具有內(nèi)源的防控因子防控松材線蟲。