徐蘭英,金 麗,許 引,張藝凡,劉思思,龍 濤

(黃岡師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,催化材料及制備湖北省重點實驗室,湖北黃岡 438000)

昆侖雪菊是菊科金雞菊屬,學(xué)名兩色金雞菊(Coreopsistinctoria,CT)。天然雪菊主要生長在高原,特別是新疆地區(qū)海拔3000 m左右的昆侖山脈。在新疆當(dāng)?shù)?昆侖雪菊不僅可以作為花茶飲料,還被用作治療高血壓和高脂血癥的民間藥物,被大眾普遍認(rèn)為是具有降血糖[1-5]、降血壓[6-9]、抗炎[10-13]、抗衰老等[14-16]功效的傳統(tǒng)保健食品,引起研究者廣泛關(guān)注。

雪菊含有多種植物化學(xué)成分,其中黃酮類化合物含量尤為豐富[17-20]。國內(nèi)外的研究表明,黃酮類化合物具有許多生理活性和藥用價值,例如抗氧化作用、癌癥預(yù)防和抑制炎癥及其相關(guān)疾病[21-26],昆侖雪菊總黃酮含量的高低是評判其質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一,因此對雪菊總黃酮含量進(jìn)行準(zhǔn)確測定具有重要意義。目前,雪菊總黃酮含量測定主要有NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、KAc-AlCl3法及三乙胺法。以蘆丁為參照物質(zhì),采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 絡(luò)合顯色反應(yīng)體系測定時,因雪菊中還含有綠原酸、鄰苯二酚等,這些物質(zhì)均具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu),堿性環(huán)境下與鋁離子形成絡(luò)合物,可能會對黃酮的測定造成干擾,影響總黃酮的測定[27]。三乙胺法主要測定雪菊中以芹菜素為母核的黃酮類化合物的含量,測得雪菊中的實際總黃酮含量偏低[28]。本文采用溶劑提取法提取雪菊中的總黃酮,并將總提物分別用乙酸乙酯和正丁醇萃取得乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物,采用HPLC法篩選適用于雪菊總黃酮含量測定的絡(luò)合顯色體系,建立簡單、快速、準(zhǔn)確測定昆侖雪菊總黃酮含量的方法,為昆侖雪菊質(zhì)量控制和綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆侖雪菊 吐魯番市愛麗地亞果業(yè)有限責(zé)任公司;蘆丁、表兒茶素(EC)、槲皮素、黃諾馬苷、異奧卡寧、馬里苷、奧卡寧 純度≥98%,南京景竹生物科技有限公司;乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、九水硝酸鋁、氯化鋁 分析純,上海國藥集團(tuán);甲醇、乙腈 色譜級,美國Tedia公司。

UV-1800型紫外-可見分光光度計 島津科技儀器有限公司;UPT-II-10T 型優(yōu)普系列超純水器 成都超純科技有限公司;KQ-250DB型數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 河南鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰絲特儀器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;TF-FD-1型冷凍干燥機 上海拓紛機械設(shè)備有限公司;AL-206型電子天平 上海梅特勒-托利多公司;1260 II型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雪菊總黃酮的提取及乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的制備

1.2.1.1 雪菊總黃酮提取液的制備 將干燥的雪菊花粉碎,過60目篩[10],準(zhǔn)確稱取雪菊粉末1.0 g,共5份,分別置于50 mL圓底燒瓶中,固定料液比為1∶20 (g/mL),用60%乙醇水溶液(V/V)為溶劑回流2 h,冷卻后過濾,收集濾液。將濾渣用同樣的方法重復(fù)提取兩次,合并濾液后置于容量瓶,將其定容至100 mL得雪菊總黃酮提取液,置于冰箱中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的制備 另取雪菊粉末10.0 g,按1.2.1.1的方法提取后將濾液合并,蒸餾除去乙醇,得到懸濁液,再加適量蒸餾水混勻后,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,分別合并相應(yīng)的萃取層后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾,除去溶劑后得雪菊石油醚萃取物0.2 g(油狀)、乙酸乙酯萃取物1.2 g和正丁醇萃取物0.8 g,置于冰箱中,4 ℃保存?zhèn)溆?。由于石油醚萃取物中主要是非極性揮發(fā)油,因此本研究重點討論EAE及n-BuOH-E萃取物。

1.2.2 總黃酮測定絡(luò)合顯色反應(yīng)體系考察

1.2.2.1 NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH絡(luò)合顯色反應(yīng)體系 分別精密稱取蘆丁、槲皮素、EC各5.0 mg,用甲醇200 W超聲5 min輔助溶解后,定容至25 mL,得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于冰箱中,4 ℃保存待用。

準(zhǔn)確移取0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品和雪菊總黃酮提取液各0.30 mL,分別置于10 mL容量瓶中,用70% 的甲醇-水稀釋至溶液體積約為5 mL。分別加入0.30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% NaNO2溶液,靜置5 min,再加入0.30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)3溶液,放置6 min,再加4.0 mL 1 mol/L NaOH溶液,用70%甲醇溶液定容至刻度,搖勻,靜置15 min。以70%甲醇為參比溶液,于300～600 nm進(jìn)行連續(xù)波長掃描。將硝酸鋁換成氯化鋁重復(fù)該實驗。

1.2.2.2 KAc-Al(NO3)3/AlCl3絡(luò)合顯色反應(yīng)體系 準(zhǔn)確移取0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品和雪菊總黃酮提取液各0.30 mL,分別置于10 mL容量瓶中,用70% 的甲醇-水稀釋至溶液體積約為5 mL。分別加入0.1 mol/mL Al(NO3)3溶液2 mL,放置6 min,再加入1 mol/mL KAc溶液3 mL,最后用70%甲醇溶液定容至刻度后混勻,靜置15 min。以70%甲醇為參比溶液,于250～600 nm進(jìn)行連續(xù)波長掃描。將硝酸鋁換成氯化鋁重復(fù)該實驗。

1.2.3 紫外-可見分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.3.1 NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 mL于10 mL容量瓶中,然后按照1.2.2.1中的操作步驟制備待測液,在最大吸收波長處測其吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),以吸光度(y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。將0.30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)3溶液換成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的AlCl3溶液重復(fù)該實驗。

1.2.3.2 KAc-Al(NO3)3/AlCl3法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 mL于10 mL容量瓶中,按照1.2.2.2中的操作步驟制備待測液,并測吸光度,以濃度(x)-吸光度(y)繪制工作曲線。將2 mL 0.1 mol/L Al(NO3)3溶液換成0.1 mol/L AlCl3溶液重復(fù)該實驗。

1.2.4 雪菊EAE和n-BuOH-E層中總黃酮含量測定 分別準(zhǔn)確稱取5.0 mg EAE和n-BuOH-E萃取物,用40%的甲醇溶解并定容至25 mL,得雪菊乙酸乙酯層、正丁醇層待測液,置于冰箱中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.1 NaNO2法測雪菊不同萃取層總黃酮含量 分別準(zhǔn)確移取0.30 mL EAE和n-BuOH-E層待測液各兩份于10 mL容量瓶中,分別加入70%的甲醇-水溶液稀釋至溶液體積為5 mL,再按照1.2.2.1中的操作步驟制備待測液并測吸光度。將510 nm處的吸光度值分別代入蘆丁NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH法兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算總黃酮含量;將500 nm處的吸光度值分別代入EC NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計算總黃酮含量。平行測定三次,計算平均值。

1.2.4.2 KAc法測雪菊EAE和n-BuOH-E總黃酮含量 分別準(zhǔn)確移取0.30 mL EAE和n-BuOH-E待測液各兩份于10 mL容量瓶中,分別加入70%的甲醇-水溶液稀釋至溶液體積約為5 mL,再按照1.2.2.2中的操作步驟制備待測液并測吸光度。將415 nm處的吸光度值分別代入蘆丁KAc-Al(NO3)3/AlCl3法兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算總黃酮含量;將435 nm處的吸光度值分別代入槲皮素KAc-Al(NO3)3/AlCl3法兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算總黃酮含量。平行測定三次,計算平均值。

1.2.5 絡(luò)合顯色法測定雪菊總黃酮含量的計算 將1.2.1.1中雪菊總黃酮提取液,用KAc-AlCl3反應(yīng)體系進(jìn)行絡(luò)合,以蘆丁為參照物,檢測其總黃酮含量。

雪菊總黃酮提取液中總黃酮含量計算公式:

X=(C×V)/(m×1000)×100

式中,X(%):總黃酮的含量;C(mg/mL):由標(biāo)準(zhǔn)工作曲求得供試品溶液中總黃酮的濃度;V(mL):試樣稀釋體積倍數(shù);m(g):試樣質(zhì)量。

1.2.6 HPLC法測定EAE和n-BuOH-E層中黃酮含量

1.2.6.1 色譜條件 菲羅門反相C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,3 μm);流動相:乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液,梯度:0～10 min,12%～25%乙腈;10～20 min,25%～40%乙腈;20～25 min,40%～70%乙腈;流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測波長:280、385 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.6.2 工作曲線的建立 分別精密稱取10.0 mg黃諾馬苷、異奧卡寧、馬里苷和奧卡寧標(biāo)準(zhǔn)品,用40%甲醇200 W超聲溶解,定容至10 mL,配制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液,4 ℃保存待用。

將標(biāo)準(zhǔn)品儲備液稀釋,配制黃諾馬苷、異奧卡寧、馬里苷和奧卡寧標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度(具體濃度范圍見表3),經(jīng)HPLC檢測,以各化合物濃度(x)-峰面積(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

表3 四種主要雪菊黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表Table 3 Linear regression data of four main flavonoids in Coreopsis tinctoria

1.2.6.3 EAE和n-BuOH-E層中四種雪菊黃酮含量檢測 分別準(zhǔn)確量取1.2.1.2中配制EAE和n-BuOH-E溶液各1 mL,過0.22 μm濾膜后進(jìn)樣,按照1.2.6.1中的色譜條件進(jìn)行分析,將得到的峰面積代入工作曲線,平行測定三次,計算樣品中四種雪菊黃酮的平均含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù),計算標(biāo)準(zhǔn)誤差并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。工作曲線繪制時所有實驗數(shù)據(jù)均為重復(fù)三次的實驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮測定顯色反應(yīng)體系考察

蘆丁、槲皮素、表兒茶素和雪菊總黃酮樣品溶液在NaNO2和KAc兩種反應(yīng)體系下分別在300～600 nm和250～600 nm波長下進(jìn)行掃描。實驗在NaNO2和KAc體系中分別探究了Al(NO3)3和AlCl3兩種鋁鹽的影響,結(jié)果表明,采用不同的鋁鹽對結(jié)果幾乎無影響,因此,實驗只給出了一種結(jié)果。在NaNO2體系中,給出的是NaNO2-Al(NO3)3-NaOH絡(luò)合顯色反應(yīng)體系圖譜,在AlCl3體系中,給出的是KAc-AlCl3絡(luò)合顯色反應(yīng)體系圖譜,UV-Vis掃描結(jié)果如圖1所示。表1為兩種反應(yīng)體系下的最大吸收波長及其數(shù)據(jù)比較。

圖1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH(A)和KAc-AlCl3(B) 反應(yīng)體系紫外-可見光譜圖Fig.1 UV-visible spectrogram of NaNO2-Al(NO3)- NaOH(A)and KAc-AlCl3(B)reaction systems

由圖1和表1可以看出,在NaNO2體系條件下,槲皮素對照溶液、雪菊總黃酮提取液的UV圖譜明顯不同,且槲皮素溶液與樣品溶液的最大吸收波長相差近130 nm,因此,槲皮素不適合在該體系下作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行雪菊總黃酮含量的測定;在KAc反應(yīng)體系下,EC對照溶液、雪菊總黃酮提取液的UV圖譜明顯不同,該反應(yīng)體系條件下,EC在可見區(qū)幾乎無吸收峰,EC的最大吸收波長與樣品的最大吸收波長相差達(dá)到150 nm。因此,在該體系下,選擇EC為對照品進(jìn)行雪菊總黃酮含量的測定顯然是不合適的。

表1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH和KAc-AlCl3體系最大吸收波長Table 1 The maximum absorption wavelength of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH and KAc-AlCl3 systems

2.2 分光光度法測定雪菊黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

表2為兩種絡(luò)合反應(yīng)體系下,蘆丁、EC和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線數(shù)據(jù)。由表2可知,蘆丁作為對照品,在兩種體系下均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2≥0.9997);EC和槲皮素分別在NaNO2體系和KAc體系下,線性關(guān)系良好(R2≥0.9996)。

表2 蘆丁、EC和槲皮素對照品分別在NaNO2體系和KAc體系下工作曲線Table 2 Standard working curve of rutin,quercetin and EC under different reaction system

2.3 雪菊EAE和n-BuOH-E層中黃酮及雪菊總黃酮含量的測定

2.3.1 HPLC法測定EAE和n-BuOH-E層中黃酮含量

2.3.1.1 四種主要雪菊黃酮的HPLC檢測波長的選擇 黃諾馬苷、異奧卡寧、馬里苷、奧卡寧為雪菊中最主要的黃酮活性化合物,且含量也相對較高。黃諾瑪苷和異奧卡寧屬于二氫黃酮,采用二極管陣列檢測器檢測,測得其最大吸收波長為280 nm,馬里苷與奧卡寧為查爾酮成分,其最大吸收波長為385 nm。因此,后續(xù)實驗選擇280、385 nm雙波長檢測。

2.3.1.2 HPLC檢測四種雪菊黃酮工作曲線的建立 將黃諾馬苷、異奧卡寧、馬里苷、奧卡寧四種雪菊黃酮儲備液分別稀釋,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(x)-峰面積(y)繪制工作曲線,結(jié)果列于表3中。四種雪菊黃酮線性關(guān)系良好,R2≥0.9997。

2.3.1.3 四種主要雪菊黃酮的HPLC分離 分別取EAE和n-BuOH-E待測液,過0.22 μm濾膜后按照1.2.6.1給定的色譜條件進(jìn)行分析,每個樣品重復(fù)三次,結(jié)果如圖2和圖3所示。通過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間對比,確定峰1為黃諾馬苷(6.7 min),峰2為異奧卡寧(10.1 min),峰3為馬里苷(10.7 min),峰4為奧卡寧(15.1 min),四種黃酮均具有較好的峰形和且分離度良好,由圖2和圖3可知,EAE中異奧卡寧和奧卡寧的含量很高,n-BuOH-E中黃諾馬苷和馬里苷的含量很高。

圖2 乙酸乙酯提取物的HPLC圖Fig.2 Chromatogram of the ethyl acetate extract

圖3 正丁醇提取物的HPLC圖Fig.3 Chromatogram of the n-butanol extract

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程計算待測溶液中黃諾瑪苷、異奧卡寧、馬里苷和奧卡寧四種黃酮的含量并計算其平均含量,結(jié)果見表4,EAE和n-BuOH-E中四種主要黃酮總含量分別為48.43%和43.19%。

表4 HPLC檢測乙酸乙酯和正丁醇萃取物中四種CTFs的含量Table 4 The contents of four kinds of CTFs in EAE and n-BuOH-E determined by HPLC

2.3.2 紫外-可見分光光度法測EAE和n-BuOH-E中黃酮及雪菊總黃酮提取液中總黃酮含量 對雪菊EAE及n-BuOH-E分別在NaNO2和KAc兩種體系下進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng),在相應(yīng)波長范圍內(nèi)進(jìn)行連續(xù)波長掃描,再根據(jù)工作曲線計算其中總黃酮含量,所得結(jié)果列于表5。

表5 分光光度法檢測雪菊乙酸乙酯、正丁醇萃取物中黃酮含量Table 5 The content of flavonoids in EAE and n-BuOH-E determined by spectrophotometric method

由表5可知,以蘆丁為參照物,NaNO2反應(yīng)體系會使雪菊總黃酮含量測定值偏離實際值非常大。這是由于凡具有鄰二酚羥基的物質(zhì),均能用此法進(jìn)行絡(luò)合顯色測定。雪菊中含有很多酚類、酸類,都具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)[20],會對實驗結(jié)果造成強烈的干擾。所以以蘆丁為參照物,NaNO2體系不適合用于雪菊總黃酮含量的測定。

表6 蘆丁為對照品的KAc-AlCl3法 測定雪菊總黃酮提取液中總黃酮含量Table 6 KAc-AlCl3 method determination of total flavonoids in chrysanthemum

對比表4和表5可知,HPLC法測得的雪菊EAE和n-BuOH-E中四種CTFs的總含量分別為48.43%和43.19%,而這兩種萃取物中一定不止此4種黃酮,還存在含量低的黃酮類物質(zhì),因此采用絡(luò)合顯色法測得的總含量理論上應(yīng)大于48.43%和43.19%。由表5可知,采用KAc-AlCl3法測得的總黃酮含量結(jié)果與HPLC法結(jié)果最為接近。KAC-AlCl3顯色法對于含有鄰二酚羥基的酚類和酚酸類等化合物顯色前后在檢測波長處無吸收,從而避免了此類物質(zhì)對顯色的干擾。槲皮素為蘆丁的苷元,3位羥基可能對AlCl3顯色反應(yīng)有影響[29]。EC屬于黃烷-3-醇類化合物,與雪菊主要黃酮結(jié)構(gòu)存在一定差異。因此,確定雪菊乙酸乙酯及正丁醇萃取物中總黃酮含量最佳測定方法為以蘆丁為參照物的KAc-AlCl3法。采用該方法對雪菊總黃酮提取液中總黃酮進(jìn)行測定,連續(xù)測定5次,結(jié)果平均值為10.65%,RSD為5.5%。

3 結(jié)論

本文采用分光光度法分別以蘆丁、槲皮素、表兒茶素為對照品,不同絡(luò)合顯色體系包括NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH和KAc-Al(NO3)3/AlCl3對雪菊乙酸乙酯及正丁醇萃取物中黃酮含量進(jìn)行檢測,通過HPLC法篩選出最佳體系為以蘆丁為對照品的KAc-AlCl3法,并在最佳體系條件下測得雪菊總黃酮提取液中總黃酮的含量,本文為其它天然產(chǎn)物中黃酮含量準(zhǔn)確測定提供了參考。同時,該測定方法靈敏度高、重復(fù)性好,且操作簡單快速,成本較低,可為雪菊黃酮類成分深入研究及其在功能食品和藥品方面的質(zhì)量監(jiān)控提供科學(xué)參考。