趙 宇,王 錚,高曉晨,孫 堯,高 冷,*

(1.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春 130012; 2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院,吉林長春 130117)

雙陽梅花鹿是世界首例鹿科動物定型品種,是世界上第一個通過人工培育定型的優(yōu)良梅花鹿品種[1-2]。鹿鮮胎是指從懷孕母鹿腹中取出的整個子宮,其內(nèi)包括成型小鹿、胎衣及羊水[3]。據(jù)報道,初生仔鹿乳胎的理化性質(zhì)與胎兒無差異,可通用[4]。鹿胎當(dāng)前大多應(yīng)用于我國和東南亞地區(qū)[5]。

研究表明,鹿胎中含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核酸、維生素等[6-8],其中的多肽類生物活性物質(zhì)具有增強機體免疫功能、調(diào)節(jié)機體內(nèi)分泌、維持機體正常功能、延緩衰老和抗癌等功效,因此鹿胎是一種較為理想的免疫調(diào)節(jié)劑和營養(yǎng)美容保健品[9-10]。但目前國內(nèi)外對雙陽梅花鹿鹿鮮胎沒有深入研究,對其的研究主要集中在作為基礎(chǔ)性初級鹿源性藥材使用。

本文以雙陽梅花鹿鹿鮮胎為原料,采用單因素實驗和響應(yīng)面法優(yōu)化鹿鮮胎多肽最佳酶解工藝,并通過SDS-PAGE電泳測定鹿鮮胎蛋白分子量分布[11-14],采用超濾法[15-17]和凝膠過濾層析法對酶解產(chǎn)物進行分離純化,進而對其抗氧化活性進行研究[18-21],為雙陽梅花鹿鹿鮮胎今后的產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙陽梅花鹿 長春金鹿鹿產(chǎn)品經(jīng)銷公司;SephadexG-50 上海研卉生物科技有限公司;中性蛋白酶(6×104U/g)、堿性蛋白酶(2×105U/g)、胰蛋白酶(250 U/mg)、木瓜蛋白酶(400 U/mg)等其他常規(guī)試劑 由北京奧星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

LGJ-30冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;TGL16M高速冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;UV-3000PC紫外可見分光光度計 杭州俊升科學(xué)器材有限公司;HA221-50-06型超臨界萃取裝置 江蘇華安科研儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原材料預(yù)處理 將鹿鮮胎用生理鹽水洗凈后去除筋膜、血管,使用生理鹽水浸泡去淤血,瀝干水分后切成小塊、剪碎,與羊水一同采用CO2超臨界萃取法進行脫脂,最后將處理過的樣品冷凍干燥后打碎。

1.2.2 超聲助提法提取鹿鮮胎蛋白 稱取50 g預(yù)處理后的鹿鮮胎粉置于燒杯中,加入1000 mL去離子水,攪拌均勻后在20 ℃下超聲40 min。超聲結(jié)束后先用濾布進行粗濾,然后在4 ℃下以5000 r/min離心20 min,取上清液濃縮后進行冷凍干燥得到鹿鮮胎蛋白。

1.2.3 鹿鮮胎多肽最佳酶解工藝研究

1.2.3.1 鹿鮮胎多肽蛋白酶的選擇 稱取10 g鹿鮮胎蛋白樣品5份分別置于燒杯中,加入100 mL去離子水,取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶各4000 U/g,將pH分別調(diào)至7、7、10、7.5和7,分別在55、50、50、37和50 ℃下對樣品酶解5 h,然后對樣品的水解度進行測定。其中復(fù)合蛋白酶由水解程度最好的三種單酶按加酶量1∶1∶1復(fù)合而成。

1.2.3.2 鹿鮮胎多肽單因素實驗 稱取10 g鹿鮮胎蛋白樣品置于燒杯中,加入200 mL去離子水?dāng)嚢杈鶆?調(diào)節(jié)pH到7.0加入5000 U/g的復(fù)合蛋白酶,分別在40、45、50、55、60 ℃下酶解5 h后,將溫度提升至100 ℃加熱煮沸10 min,待蛋白酶完全滅活后,靜置使其冷卻后再放入離心機中3800 r/min離心20 min,取上清液,采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度。

稱取10 g鹿鮮胎蛋白樣品置于燒杯中,加入200 mL去離子水?dāng)嚢杈鶆?調(diào)節(jié)pH到7.0加入5000 U/g的復(fù)合蛋白酶,在55 ℃下分別酶解1、2、3、4、5 h后,將溫度提升至100 ℃加熱煮沸10 min,待蛋白酶完全滅活后,靜置使其冷卻后再放入離心機中3800 r/min離心20 min,取上清液,采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度。

稱取10 g鹿鮮胎蛋白樣品置于燒杯中,加入200 mL去離子水?dāng)嚢杈鶆?分別調(diào)節(jié)pH到6、6.5、7.0、7.5、8后加入5000 U/g的復(fù)合蛋白酶,在55 ℃下酶解5 h后,將溫度提升至100 ℃加熱煮沸10 min,待蛋白酶完全滅活后,靜置使其冷卻后再放入離心機中3800 r/min離心20 min,取上清液,采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度。

稱取10 g鹿鮮胎蛋白樣品置于燒杯中,加入200 mL去離子水?dāng)嚢杈鶆?調(diào)節(jié)pH到7.0后,分別加入2000、3000、4000、5000、6000 U/g的復(fù)合蛋白酶,在55 ℃下酶解5 h后,將溫度提升至100 ℃加熱煮沸10 min,待蛋白酶完全滅活后,靜置使其冷卻后再放入離心機中3800 r/min離心20 min,取上清液,采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度。

1.2.3.3 鹿鮮胎多肽響應(yīng)面優(yōu)化 通過單因素實驗可以了解到,當(dāng)酶解時間超過3 h后鹿鮮胎多肽水解度幾乎不變,因此利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗,探究兩兩因素交互作用時暫不考慮該因素,為確保酶解相對完全,因此默認酶解時間為5 h。通過Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗的設(shè)計,得到最優(yōu)的鹿鮮胎多肽酶解工藝。因素與水平編碼表如表1所示。

表1 響應(yīng)面實驗因素與水平表Table 1 Factors and levelsTable of response surface experiment

1.2.3.4 水解度測定 甲醛滴定法測定氨基氮含量[22-23],凱氏定氮法[24-25]測定樣品中總氮含量,按下列公式計算:

1.2.4 鹿鮮胎蛋白酶解前后分子量測定 稱取10 g鹿鮮胎蛋白樣品5份分別置于燒杯中,加入100 mL去離子水,分別取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶適量,在各自最佳酶解條件下對樣品酶解5 h,其中復(fù)合蛋白酶按本研究所得最佳酶解工藝進行制備,滅酶冷卻后再放入離心機中3800 r/min離心20 min,取上清液得到各蛋白酶酶解產(chǎn)物。通過SDS-PAGE電泳對鹿鮮胎蛋白及其酶解產(chǎn)物的分子量分布進行測定。將各樣品均配制成1 mg/mL 的溶液,加入上樣Buffer后,在100 ℃下煮沸5 min,12000 r/min離心1 min后,再與標準蛋白 Marker溶液分別上樣10 μL,分離膠和濃縮膠質(zhì)量濃度分別為12%和8%。電泳結(jié)束后,用考馬斯亮藍 R-250 對凝膠片進行染色,脫色后的凝膠片用電泳自動成像儀拍照。

1.2.5 鹿鮮胎多肽的分離純化

1.2.5.1 超濾法分離鹿鮮胎多肽 將10 kDa的超濾離心管放入0.2 mol/L NaOH中浸泡1h后用蒸餾水清洗干凈,在放入0.2 mol/L HCl中浸泡1 h,用蒸餾水沖洗干凈,自然晾干后放入復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物,放入離心機中,以4000 r/min離心30 min,收集超濾管外溶液,冷凍干燥后備用[26]。

1.2.5.2 凝膠過濾層析法純化鹿鮮胎多肽 將預(yù)處理后的SepHadex G-50葡聚糖凝膠進行裝柱,把超濾所得的樣品配制成10 g/L的多肽水溶液進行上樣,洗脫液為去離子水,洗脫速度為0.5 mL/min[27],紫外檢測波長為280 nm,每隔5 min收集各峰組分。

1.2.5.3 分離純化產(chǎn)物分子量測定 通過SDS-PAGE電泳對分離純化產(chǎn)物的分子量分布進行測定。將各樣品均配制成1 mg/mL的溶液,加入上樣Buffer后,在100 ℃下煮沸5 min,12000 r/min離心1 min后,再與標準蛋白Marker溶液分別上樣5 μL,分離膠、夾層膠和濃縮膠的制膠體積比為:4∶1.5∶1。電泳結(jié)束后,用考馬斯亮藍R-250 對凝膠片進行染色,脫色后的凝膠片用電泳自動成像儀拍照。

1.2.6 鹿鮮胎多肽各組分的體外抗氧化活性研究

1.2.6.1 待測液的制備 按照1.2.4的試驗方法制備各蛋白酶酶解液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復(fù)3次,試驗結(jié)果用平均值表示;通過Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面設(shè)計及優(yōu)化分析;采用Excle繪圖;采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿鮮胎多肽最佳酶解工藝研究

2.1.1 鹿鮮胎多肽蛋白酶的選擇 由圖1可知,四種單酶對鹿鮮胎蛋白的水解能力依次是:木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶>堿性蛋白酶,選取前三種單酶按加酶量1∶1∶1的比例進行復(fù)合,同時對鹿鮮胎蛋白進行水解,結(jié)果表明復(fù)合蛋白酶的水解度最高,因此選擇復(fù)合蛋白酶作為工具酶。

圖1 不同蛋白酶對鹿鮮胎蛋白的水解度Fig.1 Degree of hydrolysis of the deer fetus protein by different proteases

2.1.2 酶解工藝單因素實驗結(jié)果 復(fù)合蛋白酶酶解鹿鮮胎蛋白的單因素實驗結(jié)果如圖2所示。由圖2A可知,鹿鮮胎蛋白水解度隨溫度的升高先上升后下降,在55 ℃時水解度達到最高,這可能因為過高的溫度會使蛋白酶穩(wěn)定的分子構(gòu)象被破壞,導(dǎo)致蛋白酶失活;由圖2B可知,水解度隨時間的增加先上升后趨于平穩(wěn),這可能由于底物濃度一定,反應(yīng)時間增長,底物濃度減小,反應(yīng)逐漸終止;由圖2C可知,水解度隨pH的增大呈現(xiàn)先升后降的趨勢,在pH為7時水解度達到最大;由圖2D可知,水解度隨加酶量的增加先明顯上升后呈現(xiàn)略微下降的趨勢,這可能由于超過5000 U/g后,酶分子趨于飽和,蛋白酶水解作用相對減弱。

圖2 各因素對鹿鮮胎多肽水解度的影響Fig.2 Effects of various factors on polypeptide hydrolysis degree of fresh deer foetus

2.2 酶解工藝響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果與方差分析 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。根據(jù)各項的回歸系數(shù)建立回歸模型,二次多項回歸方程為:

表2 鹿鮮胎多肽響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of polypeptide response surface for fresh fetus of deer

Y=32.65-0.61A+0.56B+0.35C+0.41AB+0.03AC+0.21BC-2A2-2.5B2-2.15C2

回歸模型的方差分析如表3所示,其中回歸方程的模型P<0.0001,F=85.59,說明模型差異性極顯著;模型失擬性P=0.4417>0.05,說明失擬不顯著,這代表未知因素對試驗干擾較小;模型決定系數(shù)R2=0.9910,調(diào)整決定系數(shù)RAdj=0.9794,說明該模型能解釋97.94%的響應(yīng)值變化,即變化來源于所取的三個因素,因此回歸模型理想,優(yōu)化條件可靠,可使用該模型對鹿鮮胎蛋白水解度進行預(yù)測和分析。由回歸方程各項方差分析可知:一次項三個因素A、B、C,二次項A2、B2、C2均對鹿鮮胎蛋白水解度有極顯著影響,交互項AB有顯著影響(P<0.05),這表明各因素對響應(yīng)值的影響不只是線性關(guān)系,而是復(fù)雜的二次關(guān)系。

表3 鹿鮮胎多肽響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 3 Results of anova for polypeptide response surface of fresh deer foetus

為進一步分析各因素對響應(yīng)值的影響,繪制了響應(yīng)面圖如圖3所示。響應(yīng)曲面越陡表示單因素變化時響應(yīng)值敏感,反之則不敏感;等高線為橢圓形則表示交互作用顯著,為圓形則不顯著。由圖3可知,加酶量與酶解溫度之間的交互對響應(yīng)值影響顯著,與方差分析結(jié)果一致,方差分析結(jié)果雖然顯示加酶量與pH和酶解溫度與加酶量的交互作用不顯著,但由圖可知它們的交互作用對響應(yīng)值也存在一定影響。

圖3 各因素交互作用對水解度的影響Fig.3 Effect of interaction of various factors on hydrolysis degree

2.2.2 鹿鮮胎多肽最佳酶解條件確定及驗證 通過Design-Expert 8.0.6軟件進行回歸分析,得到鹿鮮胎蛋白酶解最優(yōu)條件為:酶解時間5 h,酶解溫度為54.3 ℃,pH為7.05,加酶量為5085.05 U/g,該條件下水解度預(yù)測值為34.51%。為方便實際操作將酶解溫度設(shè)為54.5 ℃,pH設(shè)為7.0,加酶量設(shè)為5100 U/g,酶解時間為5 h,在此條件下進行3次驗證試驗,得到水解度平均值為34.97%,理論值與實際值誤差不超過0.46%,表明該模型可以用于鹿鮮胎多肽制備的實際生產(chǎn)中。研究水解度較高,可能是由于3種酶進行復(fù)合的蛋白酶能夠催化分解的基團更多,水解能更強。

2.3 鹿鮮胎多肽分子量分布測定結(jié)果

鹿鮮胎多肽分子量分布測定結(jié)果如圖4所示,泳道2顯示未酶解鹿鮮胎蛋白分子量主要集中在72、55和17 kDa,泳道3～7與泳道2相比條帶數(shù)減少,說明大分子蛋白被降解。其中泳道4條帶數(shù)最少且條帶集中于10～17 kDa,說明復(fù)合蛋白酶的效果最佳。

圖4 鹿鮮胎多肽SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE map of fresh deer foetus

2.4 鹿鮮胎多肽分離純化結(jié)果

將鹿鮮胎多肽樣品通過SepHadex G-50凝膠過濾層析柱分離后,收集1～200 min的洗脫液,在280波長下測每管的吸光值,結(jié)果如圖5所示。所收集的洗脫液在280 nm處有三個峰值,將其依次命名為DFP1、DFP2、DFP3,收集各組分凍干待用。分離純化產(chǎn)物分子量測定如圖6所示,三個組分的分子量主要集中在7.8 kDa左右,均在10 kDa以下。

圖6 分離純化產(chǎn)物SDS-PAGE圖譜Fig.6 SDS-PAGE map of isolated and purified product注:泳道1:蛋白Maker(3.3～20.1 kDa); 泳道2:DFP3;泳道3:DFP2;泳道4:DFP1。

圖5 鹿鮮胎多肽的SepHadex G-50柱層析洗脫圖譜Fig.5 Eluting map of fresh deer fetal polypeptide by SepHadex G-50 column chromatography

2.5 鹿鮮胎多肽抗氧化活性研究結(jié)果

表4 鹿鮮胎多肽各組分的體外抗氧化活性研究Table 4 Study on antioxidant activity of peptides from fresh deer fetal

各組分的自由基清除率均隨多肽濃度的增加而升高,根據(jù)自由基清除率和IC50值可知,未經(jīng)分離純化的6個組分當(dāng)中,在相同濃度下未酶解鹿鮮胎蛋白抗氧化能力低于其它5組,復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物抗氧化能力最強,這可能是由于鹿鮮胎蛋白在酶解后產(chǎn)生了其它抗氧化多肽,而復(fù)合蛋白酶水解能力最佳,其酶解產(chǎn)物中含有更多的抗氧化多肽;從復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物中分離純化所得的3個組分中,DFP2沒有抗氧化性,DFP1抗氧化能力>復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物>DFP3>其它組分,由此可知,雙陽梅花鹿鹿鮮胎多肽具有較強的抗氧化性,并且鹿鮮胎多肽的抗氧化能力是由多種多肽共同作用的結(jié)果,而不是某個單一多肽的作用,同時得到了分子量更小的具有更強抗氧化能力的多肽組分DFP1,為以后雙陽梅花鹿鹿鮮胎抗氧化的應(yīng)用與開發(fā)提供了理論依據(jù)。

3 結(jié)論