李麗 莫旭艷 李甜甜 張麗媛, 董漢松, ,

(1山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山東 泰安 271018；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；3作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018；*通信聯(lián)系人，E-mail: lyZhang@sdau.edu.cn)

水稻白葉枯病是水稻上最重要的細(xì)菌性病害，發(fā)生于熱帶和溫帶水稻產(chǎn)區(qū)[1]。最近半個(gè)世紀(jì)，水稻白葉枯病主要在中國(guó)、日本等東亞國(guó)家，菲律賓等東南亞國(guó)家或地區(qū)、美國(guó)等北美國(guó)家、澳大利亞等大洋洲國(guó)家以及非洲西部國(guó)家或地區(qū)造成持續(xù)危害[1]，常年引起的農(nóng)田水稻產(chǎn)量損失高達(dá)10%～50%[1-3]。水稻白葉枯病菌學(xué)名叫“水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)”，屬于只有活動(dòng)細(xì)胞而無(wú)休眠態(tài)芽孢的革蘭氏陰性細(xì)菌，是植物病理學(xué)研究使用的一種模式病原菌[4,5]。Xoo從水稻葉片上的氣孔或者傷口侵入水稻葉片，在葉片薄壁細(xì)胞間隙繁殖，擴(kuò)展進(jìn)入木質(zhì)部，在繁殖與擴(kuò)展過程中陸續(xù)發(fā)揮致病作用[5-7]。同包括黃單胞菌在內(nèi)的其他革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌一樣，Xoo的一個(gè)關(guān)鍵致病機(jī)制是通過Ⅲ型(typeⅢ, T3)分泌系統(tǒng)分泌效應(yīng)子(effectors)[3-6,9-13]。T3效應(yīng)子通過植物識(shí)別因子的介導(dǎo)，從細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞[10-12]，在寄主植物感病品種(cultivars or varieties)上發(fā)揮毒性(virulence, vir)亦即致病作用(pathogenicity, pth)，誘發(fā)病害[5,9-14]，而在寄主植物抗病品種或非寄主植物上行使無(wú)毒功能(avirulence,avr)，激發(fā)抗病性，經(jīng)常伴隨過敏反應(yīng)(hypersensitive response, HR)[11]。HR屬于抗病防衛(wèi)反應(yīng)，表現(xiàn)為植物器官在受侵染的部位快速發(fā)生細(xì)胞死亡，抑制病菌生長(zhǎng)繁殖與擴(kuò)展蔓延，保護(hù)植物免受進(jìn)一步侵害[14]。

與植物病原黃單胞菌其他種類一樣，Xoo通過T3分泌系統(tǒng)分泌類似于轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)子(transcription-activator-like effectors, TALEs)和non-TALE蛋白質(zhì)共近40種效應(yīng)子[2,15]。TALEs包括冠名為Pth和Avr的蛋白質(zhì)，non-TALEs主要是“黃單胞菌細(xì)胞外蛋白質(zhì)(Xanthomonas outer proteins,Xops)”[2]。TALEs通過調(diào)控它們?cè)谥参矬w內(nèi)的靶標(biāo)基因SWEET的表達(dá)而發(fā)揮致病作用的機(jī)制已得到深入研究[5,16-19]，其中了解最清楚的是PthXo1操縱水稻OsSWEET11 (異名Xa13)基因表達(dá)的分子機(jī)制與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)以及OsSWEET蛋白質(zhì)作為糖分運(yùn)輸載體的生化機(jī)理[3,9-13,16-19]，但關(guān)于Xops的功能機(jī)制卻了解較少。從不同種類黃單胞菌鑒定出的Xops現(xiàn)已多達(dá)30種以上[15]，但病理功能得到研究的只有7種(XopD、XopN、XopQ、XopR、XopX、XopZ、XopAO1)，而且來自不同種類而非同一種細(xì)菌，寄主植物也是多種而非一種[20-25]。例如，在侵染番茄的過程中，辣椒斑點(diǎn)病菌(X. campestrispv. vesicatoria,Xcv)分泌的XopD發(fā)揮毒性作用，抑制番茄水楊酸與茉莉酸介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)[20]。同時(shí)，XopD通過擬泛素化作用來削弱乙烯介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子SIERF4編碼基因的表達(dá)，并抑制SIERF4蛋白質(zhì)產(chǎn)生[21]。水楊酸和乙烯/茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)植物抗病性的調(diào)控作用通常相反[26]，Xcv侵染番茄而分泌的XopD同時(shí)抑制這三種激素信號(hào)傳導(dǎo)，機(jī)制尚不明確。木薯萎焉病菌(X. axonopodispv.manihotis)產(chǎn)生至少17種Xops，其中XopX、XopZ、XopAO1對(duì)病菌的完全毒性起決定作用，XopN與XopQ毒性功能冗余，XopR和XopAO1抑制木薯抗病免疫反應(yīng)[23]?？梢姡瑢?duì)不同病菌產(chǎn)生的不同Xops進(jìn)行全面研究闡釋，尚需時(shí)日。

表1 供試水稻品種中白葉枯病的抗病基因及基因表達(dá)產(chǎn)物Table 1. Xoo-relevant resistance gene and encoding proteins in the tested rice varieties.

較之上述Xops，XopN病理功能得到較好的研究。XopN有分子接頭的結(jié)構(gòu)特征，可能通過結(jié)合植物免疫反應(yīng)因子而發(fā)揮毒性作用[27]，互作的抗病免疫因子已知有14-3-3蛋白質(zhì)家族成員[25]。在侵染過程中，Xcv產(chǎn)生的XopN與番茄14-3-3蛋白質(zhì)TFT1結(jié)合，從而抑制TFT1對(duì)病原物模式分子觸發(fā)的免疫反應(yīng)(pattern-triggered immunity, PTI)的調(diào)控能力[25]。此外，XopN對(duì)甘藍(lán)褐腐病菌(X. campestrispv.campestris)[28]、水稻條斑病菌(X. oryzaepv.orizicola)[29]和Xoo[30]毒性的貢獻(xiàn)也得到確認(rèn)。XopN決定Xoo菌株KXO85對(duì)水稻感病品種Dongjin的毒性，與水稻抗病相關(guān)蛋白質(zhì)VOZ2互作，調(diào)控病菌毒性[30]。這些研究提出了一個(gè)問題，即XopN的病理功能是否因水稻品種對(duì)病菌的抗感性(susceptibilities)而異？作者使用Xoo標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)XO99A和水稻不同品種進(jìn)行研究，試圖解答這個(gè)問題。目前對(duì)PXO99A產(chǎn)生的XopN的認(rèn)知，僅限于它是一種Ⅲ型效應(yīng)子，病理功能還有待揭示[3,15]。本研究主要測(cè)定了PXO99A對(duì)水稻14個(gè)品種的毒性，分析了XopN基因敲除和回補(bǔ)對(duì)病菌毒性的影響，以及病菌毒性與水稻OsSWEET11基因誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果表明，XopN是一個(gè)有限廣譜性(pluripotent)效應(yīng)子。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物

病菌毒性測(cè)定使用了14個(gè)水稻品種(表1)，各含至少1個(gè)抗性基因[31]，基因產(chǎn)物性質(zhì)不同[32-35]，植物HR測(cè)定使用本氏煙(Nicotiana benthamiana)。兩種植物均在裝有植物培養(yǎng)基質(zhì)(PINOSTR substrate)的花盆內(nèi)培育，煙草種子播種后10 d移栽，水稻采用催芽的方式培育。催芽和幼苗培育均使用26℃～28℃植物培育室(12 h光照/12 h黑暗)。

1.1.2 供試菌株與質(zhì)粒

供試細(xì)菌菌株、質(zhì)粒載體或重組載體有從專業(yè)公司購(gòu)買的，也有參與本研究的師生先后在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)(南京)和山東農(nóng)業(yè)大學(xué)(泰安)構(gòu)建的(表2)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病菌XopN基因敲除

構(gòu)建基因敲除載體所用引物依據(jù) NCBI(National Center Biotechnology Information)上PXO99A的全基因組序列，設(shè)計(jì)XopN上游序列(F1,996 bp)和下游序列(F2, 794 bp)的引物(表 3)，由金斯瑞生物公司合成。以PXO99A基因組DNA為模板，用ExTaq酶擴(kuò)增XopN基因的上游片段F1和下游片段F2。將擴(kuò)增好的F1、F2片段用TA克隆連接到pMD19-Ts載體上，挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)序。用同種方法將擴(kuò)增好的卡那霉素(Kan)基因連接到載體 pMD20-T上，挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)序。挑選測(cè)序正確的片段，利用對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)將 F1、F2片段從載體pMD19-Ts上酶切下來，凝膠回收正確的F1、F2片段，連接到pMD20-T(帶有正確的Kan片段)載體上，構(gòu)建XopN的敲除重組載體pMD20-T::F1::Kan::F2。制備PXO99A感受態(tài)細(xì)胞，將敲除重組載體電轉(zhuǎn)PXO99A感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌接到NA培養(yǎng)基上，放入28℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。待長(zhǎng)出單菌落，將單菌落分別對(duì)應(yīng)，點(diǎn)在含有氨芐霉素和卡那霉素的NA培養(yǎng)基上，再放入28℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2 d，對(duì)單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，為驗(yàn)證目的基因敲除效果。另外，本實(shí)驗(yàn)室此前使用上述類似方法對(duì)XopQ進(jìn)行敲除，獲得突變菌株ΔXopQ[33]。

表2 供試菌株與質(zhì)粒Table 2. Bacterial strains and plasmid vectors used and created in this study.

表3 用于病菌XopN基因敲除和回補(bǔ)的PCR引物相關(guān)信息Table 3. Information of primers used in PCR protocols for Xoo XopN knockout and complementation.

1.2.2ΔXopN突變體遺傳回補(bǔ)

根據(jù)諾唯贊公司的一步法克隆試劑盒（One Step Cloning Kit）使用說明書設(shè)計(jì)引物(表 3)，以PXO99A的DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增XopN全長(zhǎng)(表3)。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ分別將擴(kuò)增好的XopN片段和 pHMI載體進(jìn)行酶切，將酶切后的產(chǎn)物純化后進(jìn)行重組反應(yīng)。反應(yīng)體系包括 5×CE Ⅱ緩沖液4 μL，線性化克隆載體50～200 μg，插入擴(kuò)增片段產(chǎn)物20～200 ng，ExnaseTMⅡ 2 μL，加dd H2O至20 μL。反應(yīng)后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂板，待長(zhǎng)出單菌落后挑選單菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定，將菌落PCR鑒定為陽(yáng)性克隆的單菌落再用 Hind Ⅲ酶進(jìn)行酶切鑒定。將驗(yàn)證成功的回補(bǔ)載體送測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的pHMI::XopN回補(bǔ)載體，電轉(zhuǎn)入ΔXopN感受態(tài)細(xì)胞中，菌液涂布于含有卡那霉素的NA培養(yǎng)基上，在28℃條件下培養(yǎng)3 d，將長(zhǎng)出的單菌落搖菌提取基因組，用作模板，使用XopN基因的特異引物，通過PCR進(jìn)行驗(yàn)證，PCR結(jié)果為陽(yáng)性的即為ΔXopN突變體回補(bǔ)菌株。

表4 水稻基因及其RT-PCR與RT-qPCR分析所用引物信息Table 4. Information on rice genes and their primers used for RT-PCR and RT-qPCR analyses.

1.2.3 細(xì)菌繁殖量測(cè)定

將 PXO99A、ΔXopN和ΔXopQ細(xì)菌儲(chǔ)備物移入營(yíng)養(yǎng)肉湯(nutrient broth, NB)培養(yǎng)液，活化培養(yǎng)至OD600=1，各取20 μL菌液轉(zhuǎn)入新的NB培養(yǎng)液，28 ℃下振蕩培養(yǎng)，在10～24 h期間每隔2 h取樣，測(cè)定不同菌株 NB培養(yǎng)物的 OD600值，然后通過Excel制作細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 接種實(shí)驗(yàn)

接種采取兩種通用方法，即剪葉和注射[9-14]。使用剪葉接種法時(shí)，剪刀先用OD600為0.5的菌懸液蘸一下，立即剪切水稻葉片尖端約3 mm的部分。使用一個(gè)月齡的水稻苗，每個(gè)菌株接種6株幼苗，各選取心葉下方的2張完全展開葉片進(jìn)行接種。接種3 d后，取樣測(cè)定細(xì)菌繁殖量，14 d后測(cè)量病斑長(zhǎng)度。注射法接種使用 14日齡的水稻苗，每個(gè)菌株接種6株稻苗，各注射6張葉片，3 d后測(cè)定葉片含菌量。無(wú)論剪葉還是注射接種，葉片含菌量測(cè)定都是采用細(xì)菌回收的方法。每株稻苗取3張葉片，用酒精棉球表面消毒后，用經(jīng)過滅菌的打孔器(0.5 cm×0.5 cm, 0.19625 cm2)取葉圓片，葉圓片再用滅菌的剪刀剪碎，葉片碎片置于3 mL滅菌水中，借助研棒用力研磨。含菌的葉片組織研磨物懸浮液經(jīng)10倍系列稀釋后，各取10 μL，涂布在含相應(yīng)抗生素的NB瓊脂(NB agar, NA)培養(yǎng)基平板上，28℃下培養(yǎng)3～5 d，計(jì)數(shù)菌落形成單位(colony formation unit,cfu)。

1.2.5 水稻基因克隆和表達(dá)分析

根據(jù)已知信息(表3)，從水稻不同品種克隆抗病(感病)基因，包括 IRBB13的隱性抗病基因 xa13(OsSWEET11)[33]、日本晴顯性感病基因 Xa13(OsSWEET11)[35]、IRBB208和Asominori可能含有的OsSWEET11同源基因。水稻這4個(gè)品種30日齡幼苗所有葉片均剪葉接種，分別接種 PXO99A、ΔXopN和ΔXopN/XopN。一部分幼苗立即取樣，另一部分幼苗到24 h再取樣，均剪取全部葉片，立即提取RNA，兩次提取的RNA依次用于基因克隆和表達(dá)分析。采用RT-PCR克隆的方法，使用不同引物(表4)，從水稻上述品種克隆相應(yīng)的抗病(感病)基因。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)過測(cè)序和BLAST比對(duì)，確認(rèn)基因或同源物。通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR (RT-qPCR)來測(cè)定基因表達(dá)水平[10]。

1.2.6 煙草HR測(cè)定

通過NA培養(yǎng)活化PXO99A、ΔXopN、ΔXopN/XopN細(xì)菌，挑選單菌落移入NB培養(yǎng)液，于28 ℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng) 16～18 h。收集培養(yǎng)液，離心沉淀菌體，菌體用純水懸浮，重復(fù)離心1次，沉淀的菌體再用純水懸浮，稀釋菌懸液至 OD600=0.5。選取5～6葉期的本氏煙，用一次性注射器吸取細(xì)菌懸浮液，在葉片側(cè)脈之間約中心點(diǎn)注入葉肉細(xì)胞間隙。到12 h，用臺(tái)盼藍(lán)染色法[37]顯示葉片細(xì)胞過敏性死亡(microscopic HR, micro-HR)情況，并于12～36 h觀察HR。

圖1 PXO99A的XopN基因敲除Fig. 1. XopN gene knockout from PXO99A.

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，即包括至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果一致時(shí)予以使用。對(duì)定量分析獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用IBM SPSS19.0軟件中文指導(dǎo)書[38]和配套的軟件包進(jìn)行三項(xiàng)統(tǒng)計(jì)分析。一、使用Levene方差齊性檢驗(yàn)來檢驗(yàn)方差整齊性。二、使用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)和P-P圖，確認(rèn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布。三、差異顯著性測(cè)定，又有兩種。1)成對(duì)數(shù)據(jù)比較，例如比較病菌野生型與突變菌株誘發(fā)的病斑長(zhǎng)度，通過方差分析(analysis of variance,ANOVA)和F測(cè)驗(yàn)(Fisher’s test)，估計(jì)差異顯著性。2)多重比較，例如比較野生型、突變體、遺傳回補(bǔ)的菌株誘發(fā)的病斑長(zhǎng)度，通過ANOVA和鄧肯新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)(Duncan’s multiple-range test)，估計(jì)差異顯著性。統(tǒng)計(jì)分析的材料單元根據(jù)測(cè)定的項(xiàng)目而有不同，只有病斑長(zhǎng)度以葉片為單位[39]，水稻基因表達(dá)和細(xì)菌繁殖測(cè)定則以每個(gè)樣品為單位，計(jì)為生物學(xué)重復(fù)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 XopN敲除成功

為了研究 XopN基因的病理功能，必須把它從PXO99A敲除，獲得ΔXopN突變體，對(duì)突變體進(jìn)行遺傳回補(bǔ)，獲得回補(bǔ)菌株，然后比較野生型、突變體和回補(bǔ)菌株對(duì)水稻的毒性。因此，我們首先構(gòu)建了 XopN的敲除載體 pMD20-T::F1::Kan::F2。PCR擴(kuò)增與測(cè)序驗(yàn)證表明構(gòu)建驗(yàn)證成功，重組載體所含XopN基因上游片段F1為996 bp，下游片段F2為794 bp，Kan基因?yàn)?408 bp(圖1-A)。用電擊轉(zhuǎn)化的方法，將構(gòu)建好的ΔXopN敲除重組載體轉(zhuǎn)入PXO99A感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌經(jīng)過3 d培養(yǎng)，長(zhǎng)出單菌落。然后，將單菌落分別對(duì)應(yīng)點(diǎn)在含有氨芐青霉素和卡那霉素的NA培養(yǎng)基上。若該菌落在含氨芐青霉素的平板上不能生長(zhǎng)但能夠在含卡那霉素的平板上生長(zhǎng)，則該菌落可能是XopN敲除突變體。根據(jù)這一原理，初步篩選出了XopN敲除突變體菌株。對(duì)初選菌株做了進(jìn)一步分子鑒定，挑取單菌落進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，從培養(yǎng)物提取基因組DNA用作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增Kan基因和XopN基因，挑選了4個(gè)轉(zhuǎn)化子，均具有Kan基因(圖1-B)，其中轉(zhuǎn)化子1不含XopN基因(圖1-C)，說明它是敲除了XopN的PXO99A突變體ΔXopN。

2.2 ΔXopN突變體回補(bǔ)成功

為了后續(xù)試驗(yàn)?zāi)軌虺浞终f明XopN基因的病理功能，構(gòu)建了ΔXopN突變體的遺傳回補(bǔ)載體pHMI::XopN。用此載體轉(zhuǎn)化大腸工程菌株DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌經(jīng)過培養(yǎng)長(zhǎng)出單菌落。這樣的單菌落用來進(jìn)行菌落PCR和酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明回補(bǔ)載體pHMI::XopN構(gòu)建成功(圖2-A)。將構(gòu)建成功的pHMI::XopN質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入ΔXopN敲除突變體感受態(tài)，涂布在含有鏈霉素和壯觀霉素的NA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后長(zhǎng)出單菌落。從這種單菌落提取DNA，通過PCR擴(kuò)增XopN基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果見圖 2-B。其中，轉(zhuǎn)化子 1、2、3含有 XopN基因，基因擴(kuò)增效果與陽(yáng)性對(duì)照(control)相當(dāng)。轉(zhuǎn)化子1、2、3就是ΔXopN突變體的回補(bǔ)菌株，記做ΔXopN/XopN。

圖2 突變體ΔXopN遺傳回補(bǔ)效果驗(yàn)證Fig. 2. Genetic complementation of the ΔXopN mutant.

圖3 Xoo不同菌株在NB液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig. 3. Bacterial population of the indicated Xoo strains in NB medium.

2.3 XopN影響細(xì)菌繁殖

為了探討XopN敲除是否影響細(xì)菌在培養(yǎng)基上繁殖的能力，我們把 Xoo野生型菌株 PXO99A和XopN敲除突變體ΔXopN在NB液體培養(yǎng)上進(jìn)行培養(yǎng)，于10～24 h內(nèi)每隔2 h做一次細(xì)菌繁殖量測(cè)定。已知XopQ與XopN一樣，也是PXO99A的一個(gè)效應(yīng)因子，較之 PXO99A，XopQ敲除突變體ΔXopQ的繁殖量大為降低[24,33]。因此，我們對(duì)ΔXopQ做了同步測(cè)定。以NB培養(yǎng)液為對(duì)照，不同菌株在NB培養(yǎng)液中細(xì)菌繁殖量的變化曲線見于圖 3。圖上顯示，從14 h起，突變體菌株ΔXopN、ΔXopQ的繁殖速度慢于野生型PXO99A，ΔXopN比ΔXopQ繁殖速度更慢，到24 h相差約10倍。這說明，XopN和XopQ對(duì)細(xì)菌繁殖速度都有影響，比較來看，XopN的影響更大一些。

2.4 對(duì)水稻14個(gè)品種的測(cè)試表明XopN決定病菌在其中4個(gè)品種上的毒性水平

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室[9-13,31,36]和世界同行[32-35]的相關(guān)研究，我們選出14個(gè)水稻品種(表1)，即IRBB1、IRBB3、IRBB8、IRBB10、IRBB13、IRBB14、IR24、IRBB203、IRBB204、IRBB205、IRBB208、IRBB211、Asominori、日本晴(Nipponbare)，用來評(píng)估 XopN毒性功能的?；猿潭?。通過接種實(shí)驗(yàn)，采取兩項(xiàng)通用的指標(biāo)[9-14,20-25]測(cè)評(píng)Xoo不同菌株對(duì)水稻不同品種的毒性：一是水稻葉片白葉枯癥狀嚴(yán)重程度；二是細(xì)菌在水稻葉片內(nèi)的繁殖量。

圖4 用XopN與PXO99A剪葉接種水稻不同品種引起的白葉枯病斑長(zhǎng)度Fig. 4. Lesion Length of leaf blight caused by the Xoo strains in different rice varieties.

首先，我們用野生型菌株P(guān)XO99A和ΔXopN突變體的細(xì)菌懸浮液(OD600=0.5)分別對(duì)上述 14個(gè)水稻品種的30日齡幼苗進(jìn)行剪葉接種，14 d后(兩周) 觀察白葉枯病癥狀，測(cè)量病斑長(zhǎng)度，用以評(píng)價(jià)病情嚴(yán)重度。結(jié)果顯示，PXO99A對(duì)13個(gè)水稻品種均有很強(qiáng)的毒性，引起的白葉枯病斑長(zhǎng)度平均都超過10 cm，僅對(duì) IRBB13毒性微弱(圖 4)，該品種葉片病斑長(zhǎng)度平均只有3.1 cm。PXO99A和ΔXopN在水稻10個(gè)品種上毒性相近(圖 4)，引起的葉片病斑長(zhǎng)度無(wú)顯著差別(ANOVA和F測(cè)驗(yàn))。但是，在IRBB13、IRBB208、Asominori、日本晴這4個(gè)水稻品種上，PXO99A毒性明顯高于ΔXopN突變體(圖4)。亦即，較之PXO99A，ΔXopN毒性大為減弱，在這4個(gè)水稻品種葉片上引起的病斑長(zhǎng)度顯著縮短(ANOVA和 F 測(cè)驗(yàn)，P ＜ 0.05)。

為了確認(rèn)XopN的病理功能，我們選擇水稻品種IR24(XopN基因敲除對(duì)菌株在水稻葉片上的致病性不起作用)和 IRBB208(XopN發(fā)揮作用)進(jìn)行重復(fù)接種，驗(yàn)證了ΔXopN遺傳回補(bǔ)的效果。我們制備了PXO99A、ΔXopN突變體及其回補(bǔ)菌株ΔXopN/XopN的菌懸液，循例采用剪葉接種法，對(duì)這兩個(gè)水稻品種的30日齡幼苗分別予以接種，14 d后觀察并記錄病斑長(zhǎng)度。結(jié)果顯示，回補(bǔ)菌株ΔXopN/XopN能恢復(fù) PXO99A對(duì)水稻 IR24、IRBB208的致病力(圖5)。根據(jù)ANOVA和鄧肯新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)，PXO99A、ΔXopN、ΔXopN/XopN在IR24葉片上引起的病斑長(zhǎng)度差異不顯著，但在IRBB208上，較之PXO99A或ΔXopN /XopN，ΔXopN 引起的病斑長(zhǎng)度顯著(P ＜0.01)縮短(圖5)。顯而易見，用野生型XopN基因?qū)ΖopN進(jìn)行遺傳回補(bǔ)，達(dá)到了應(yīng)有的效果。

植物體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量測(cè)定表明，XopN影響 Xoo在水稻葉片組織內(nèi)的繁殖能力和種群數(shù)量。采取注射接種法，用PXO99A、ΔXopN、ΔXopN/XopN菌懸液分別接種IR24、IRBB208的14日齡幼苗的葉片，3 d后剪取接種的葉片，從中回收病菌并進(jìn)行定量比較，結(jié)果見表 6。與病斑長(zhǎng)度結(jié)果一致，ΔXopN突變體降低了IRBB208水稻葉片組織內(nèi)的含菌量，但對(duì) IR24水稻葉片內(nèi)的含菌量沒有顯著影響，再次說明XopN對(duì)不同水稻品種的毒性存在差異。

為了在所有供試水稻品種上獲得關(guān)于病菌毒性的完整資料，根據(jù)細(xì)菌毒性測(cè)評(píng)的上述第二個(gè)參數(shù)，我們又制備了PXO99A、ΔXopN、ΔXopN/XopN細(xì)菌懸浮液，分別用來注射接種上述 14個(gè)水稻品種14日齡幼苗的葉片，3 d后剪取接種的葉片，從中回收病菌并進(jìn)行定量比較。結(jié)果顯示，病菌3個(gè)菌株在水稻 10個(gè)品種葉片內(nèi)繁殖量非常接近，只有IRBB13、IRBB208、Asominori和日本晴這4個(gè)水稻品種葉片內(nèi)，PXO99A和ΔXopN/XopN充分繁殖，但ΔXopN的繁殖能力明顯受抑，顯著降低了其種群數(shù)量(圖7)。無(wú)論與 PXO99A還是ΔXopN/XopN相比，ΔXopN在IRBB13、IRBB208、Asominori和日本晴幼苗葉片內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量都顯著降低(ANOVA和鄧肯新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)，P ＜ 0.01)。

圖5 PXO99A、ΔXopN、ΔXopN/XopN在水稻品種IR24和IRBB208上的白葉枯病病斑長(zhǎng)度Fig. 5. Lesion length of leaf blight caused by the three Xoo strains in the two rice varieties.

圖6 PXO99A、ΔXopN和ΔXopN/XopN在水稻品種IR24和IRBB208葉片內(nèi)的繁殖量Fig. 6. Bacterial population of PXO99A, ΔXopN and ΔXopN/XopN in leaves of IR24 and IRBB208.

圖7 PXO99A、ΔXopN和ΔXAopN/XopN在14個(gè)水稻品種體內(nèi)的繁殖量Fig. 7. Populations of PXO99, ΔXopN and ΔXopN/XopN bacteria multiplied in leaves of the 14 rice varieties.

綜合分析比較上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以明確看出，從水稻不同品種葉片內(nèi)的Xoo繁殖量和葉片白葉枯病癥狀差別這兩項(xiàng)評(píng)定病菌毒性的指標(biāo)[9-14,20-25]來看，敲除XopN基因?qū)oo毒性的影響因?yàn)樗酒贩N的不同而有很大差別。測(cè)定的 14個(gè)水稻品種僅有 4個(gè)(IRBB13、IRBB208、Asominori、日本晴)病理反應(yīng)受病菌效應(yīng)子XopN的影響，對(duì)Xoo的敏感性或?qū)Π兹~枯病的感病性因?yàn)椴【鶻opN的敲除與否而有顯著差別(P ＜ 0.05)。換言之，XopN決定Xoo菌株P(guān)XO99A對(duì)這4個(gè)水稻品種的毒性水平。根據(jù)病菌繁殖量和引發(fā)白葉枯病的嚴(yán)重程度，在IRBB13上，PXO99A毒性水平較低，但XopN對(duì)病菌毒性的貢獻(xiàn)很大，約占75%，而對(duì)其他3個(gè)水稻品種(IRBB208、Asominori、日本晴)，PXO99A有很強(qiáng)的毒性，但XopN對(duì)病菌毒性的貢獻(xiàn)卻比較低(分別為43%、42%、31%)。顯而易見，XopN是一個(gè)有限廣譜性(pluripotent)[40]效應(yīng)子。

2.5 XopN影響病菌誘導(dǎo)水稻OsSWEET11同源基因表達(dá)的能力

為了探討XopN毒性功能這種有限廣譜性的機(jī)制，我們考查了上述XopN發(fā)揮作用的4個(gè)水稻品種對(duì)白葉枯病抗感反應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制(表1)。IRBB13對(duì)白葉枯病的抗性取決于隱性抗病基因xa13，該基因的編碼產(chǎn)物是OsSWEET11/Xa13蛋白質(zhì)[31,33]。相反，日本晴擁有顯性的Xa13基因[35]，即xa13的等位基因[32]，Xa13編碼的OsSWEET11/XA13/Os8N3與xa13編碼的OsSWEET11/Xa13僅有三個(gè)氨基酸的差別[41]，但決定日本晴對(duì)白葉枯病的感病性，即決定菌株P(guān)XO99A對(duì)日本晴的毒性[10,12,35]。我們通過接種實(shí)驗(yàn)和RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，PXO99A對(duì)OsSWEET11/xa13在IRBB13葉片內(nèi)的表達(dá)有顯著(P＜0.01)的抑制作用，卻能大幅度提高OsSWEET11/Xa13在日本晴葉片內(nèi)的表達(dá)水平(圖8)。這種相反的影響在XopN基因敲除(ΔXopN)的情況下便不再發(fā)生，但在ΔXopN遺傳回補(bǔ)(ΔXopN/XopN)以后，又重新出現(xiàn)(圖8)。這說明XopN對(duì)病菌促進(jìn)顯性基因OsSWEET11/Xa13表達(dá)，抑制隱性基因OsSWEET11 /xa13表達(dá)起重要作用。

如前所述，與IRBB13和日本晴一樣，IRBB208和Asominori對(duì)PXO99A的敏感性也受病菌 XopN控制(圖 4～7)。但是，IRBB208和 Asominori是否擁有顯性或隱性O(shè)sSWEET1基因，文獻(xiàn)和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)均無(wú)記錄。由于PXO99A的毒性和XopN的影響在日本晴上與在IRBB208和Asominori上的效果相似(圖 4和圖 7)，我們推測(cè)，IRBB208和 Asominori可能也含有顯性基因OsSWEET1/Xa13，這一設(shè)想隨即得到實(shí)驗(yàn)支持。根據(jù)日本晴 OsSWEET1/Xa13基因 cDNA序列(登錄號(hào) AK070510)設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增該基因 cDNA全長(zhǎng)的一對(duì)引物(表 4)。這對(duì)引物用于RT-PCR，對(duì)IRBB208和Asominori在PXO99A接種前后分離的 RNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，均能得到約為1500bp的產(chǎn)物。該產(chǎn)物經(jīng)過回收、測(cè)序，測(cè)到的序列與OsSWEET1/Xa13基因cDNA序列完全相同。又根據(jù) IRBB13隱性抗病基因 OsSWEET1/xa13的DNA 序列(登錄號(hào) DQ421394.1)，選取最長(zhǎng)的第 5個(gè)也是最后一個(gè)外顯子(3701-4453bp)，設(shè)計(jì)可以覆蓋此區(qū)全長(zhǎng)的一對(duì)引物(圖 4)。這對(duì)引物用于RT-PCR，擴(kuò)增來自IRBB208和Asominori的RNA樣品，得到約為750 bp的產(chǎn)物。該產(chǎn)物經(jīng)過回收、測(cè)序，測(cè)到的序列與OsSWEET1/xa13基因DNA序列第5個(gè)外顯子序列完全相同。顯而易見，IRBB208和 Asominori擁有 OsSWEET11同源基因。由于IRBB208和Asominori感病性同日本晴相近，但顯著高于 IRBB13(圖 4)。我們推測(cè)，IRBB208和Asominori的OsSWEET11同源基因?qū)儆陲@性感病基因。然后，我們發(fā)現(xiàn)，PXO99A接種 IRBB208和Asominori以后，大幅度提高了這兩個(gè)水稻品種的OsSWEET11同源基因在各自葉片內(nèi)的表達(dá)水平(圖8)。這一作用在XopN基因敲除(ΔXopN)的情況下便不再發(fā)生，但在ΔXopN 遺傳回補(bǔ)(ΔXopN/XopN)以后，又重新出現(xiàn)(圖 8)。因此，對(duì)病菌促進(jìn)OsSWEET11同源基因在IRBB208和Asominori葉片內(nèi)表達(dá)的這一反應(yīng)，XopN起重要作用。

2.6 XopN影響Xoo誘發(fā)煙草HR的能力

為了明確XopN是否影響Xoo誘發(fā)煙草HR的能力，我們將純水制備的 PXO99A、ΔXopN、ΔXopN/XopN 3個(gè)菌株的細(xì)菌懸浮液分別注射煙草葉片，純水注射葉片用作對(duì)照(control)，在12～36 h期間觀察煙草HR反應(yīng)情況。到12 h，煙草葉片所有注射部位均未出現(xiàn)HR反應(yīng)。到24 h，對(duì)照區(qū)域無(wú)HR反應(yīng)，注射了PXO99A或ΔXopN/XopN菌懸液的部位已經(jīng)出現(xiàn)明顯的HR反應(yīng)，而在注射接種ΔXopN菌懸液的區(qū)域，HR反應(yīng)較微弱。36 h后，注射ΔXopN菌懸液的區(qū)域也出現(xiàn)了明顯的HR反應(yīng)(圖9-A)。這說明XopN基因敲除延遲HR反應(yīng)的發(fā)生。另外，煙草葉片用PXO99A菌懸液注射以后，在12 h之內(nèi)出現(xiàn)了微敏反應(yīng)，但用ΔXopN菌懸液注射的葉片，未見發(fā)生(圖9-B)，說明XopN影響病菌誘發(fā)煙草HR發(fā)生的程度。

3 討論

圖8 XopN對(duì)OsSWEET11或其同源基因在水稻4個(gè)品種葉片內(nèi)表達(dá)水平的影響Fig. 8. Effects of XopN on expression levels of OsSWEET11 or its analogs in leaves of the 4 rice varieties.

圖9 XopN對(duì)Xoo誘發(fā)煙草葉片過敏反應(yīng)的影響Fig. 9. Effect of XopN on the ability of Xoo to induce hypersensitive response in tobacco leaves.

在本研究之前，中國(guó)植物病理學(xué)學(xué)者宋從鳳教授和美國(guó)同行學(xué)者楊兵教授通過合作，從Xoo菲律賓菌株P(guān)XO99A鑒定了18種Xop效應(yīng)子[42]，中國(guó)植物病理學(xué)學(xué)者馮家勛教授課題組又從水稻黃單胞菌水稻致病變種中國(guó)菌株13751鑒定出9種Xop[43]，但是，病理功能得到研究的只有兩種。一是XopZ，它在水稻品種IR24上具有毒性作用，通過原核表達(dá)獲得的蛋白外施于本氏煙上以后，大幅度減少胼胝質(zhì)在葉片表面的沉積量[42]，說明XopZ能夠抑制植物基本防衛(wèi)反應(yīng)[44]。二是XopR，它部分決定中國(guó)菌株13751對(duì)水稻品種特優(yōu)63的低毒性，但不影響IR24的感病性[43]。另外，還有來自Xoo非洲菌株MAFF311018的XopR，病理功能通過擬南芥轉(zhuǎn)基因的病理效應(yīng)得到部分解析，在表達(dá)ZopR基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因系上，PTI受到抑制[45]。根據(jù)這些研究，聯(lián)系上文引言部分援引關(guān)于不同病菌不同Xop在不同植物上病理功能的文獻(xiàn)[20-25]，我們對(duì)Xop效應(yīng)子的了解還相當(dāng)貧乏，既缺少不同Xop功能機(jī)制的知識(shí)，又亟需探討不同水稻品種對(duì)特定Xop的病理反應(yīng)，明確某一特定的Xop發(fā)揮毒性作用的?；猿潭?。

本研究解析了PXO99A對(duì)14個(gè)水稻品種的毒性和XopN所發(fā)揮的作用。根據(jù)病菌野生型菌株P(guān)XO99A、XopN敲除突變體ΔXopN和回補(bǔ)菌株ΔXopN/XopN在水稻葉片內(nèi)的繁殖量和引起白葉枯癥狀的嚴(yán)重程度，XopN作為一個(gè)有限廣譜性(pluripotent)效應(yīng)子發(fā)揮作用，在水稻4個(gè)品種而非供試的所有14個(gè)品種上行使毒性功能，它也是Xoo培養(yǎng)繁殖的必要因子，對(duì)病菌在非寄主植物上誘發(fā)抗病防衛(wèi)反應(yīng)(HR)[44]還有增效作用。無(wú)獨(dú)有偶，與病菌效應(yīng)子功能對(duì)應(yīng)的植物抗病或感病基因，例如OsSWEET1/Xa13，也表現(xiàn)出“有限多效(pluripotent)”的功能特征[9-13,40]，既是水稻對(duì)白葉枯病感病性的決定因子[9-11,13,35]，又參與花藥和種子發(fā)育調(diào)控[46]。附帶一筆，“多能性(multipotent)”、“亞全能性(pluripotent)”、“全能性(totipotent)”通常用來區(qū)分干細(xì)胞的發(fā)育潛能，從限于長(zhǎng)成特定的而非全部的組織、器官，或限于某些生理過程，到產(chǎn)生所有胚胎細(xì)胞類型，再到產(chǎn)生所有胚胎和胚外細(xì)胞類型[47]。

推而廣之，這些界定用于病菌效應(yīng)子和植物抗病或感病基因或蛋白質(zhì)也相當(dāng)有意義[44]。正如本研究所指，XopN的毒性功能指向部分而非全部供試水稻品種。1)攜帶隱性抗病基因OsSWEET11/xa13的IRBB13[31,36]，在這個(gè)水稻品種上，PXO99A顯示弱毒性，但XopN對(duì)病菌毒性的貢獻(xiàn)卻高達(dá)70%以上。2)攜帶顯性感病基因OsSWEET11/Xa13的日本晴，是典型的白葉枯病感病品種，在此水稻品種上，PXO99A有高毒性[33-36]，而XopN對(duì)病菌毒性的貢獻(xiàn)卻只有30%左右。3)攜帶OsSWEET11/Xa13同源基因的IRBB208和Asominori，同源基因尚未發(fā)現(xiàn)進(jìn)行功能測(cè)定，缺乏遺傳和生理生化方面的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，所以指稱“同源基因”而非“顯性感病基因”。對(duì)IRBB208和Asominori，PXO99A也顯示高毒性，XopN對(duì)病菌毒性的貢獻(xiàn)率在40%左右。這些結(jié)果簡(jiǎn)單而有趣，說明了XopN和OsSWEET11功能機(jī)制的復(fù)雜性。此處要義是，它們的功能機(jī)制有助于思考和解答POX99A的XopN為什么能在上述4個(gè)水稻品種上發(fā)揮毒性作用這一問題。

先看XopN，案例見于Xcv-番茄互作體系。在侵染番茄的過程中，Xcv分泌的XopN定位于番茄細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)界面，與番茄非典型性受體型激酶TARK1互作[48]。在酵母細(xì)胞中，這個(gè)XopN還能同番茄14-3-3蛋白質(zhì)的4個(gè)同源異構(gòu)體(TFT1、TFT3、TFT5、TFT6)發(fā)生互作[48]。在番茄細(xì)胞內(nèi)，TFT1是XopN的靶標(biāo)，二者相結(jié)合，而TFT1又能結(jié)合TARK1，形成的TARK1/TFT1復(fù)合體可能為XopN發(fā)揮毒性功能提供合適的平臺(tái)結(jié)構(gòu)[25]。在此之前，XopN經(jīng)由病菌T3分泌途徑而運(yùn)輸，到達(dá)細(xì)菌-植物細(xì)胞界面，但必須繼續(xù)前進(jìn)，直到在植物細(xì)胞膜上定位。病原細(xì)菌效應(yīng)子如果在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，例如PXO99A的TALE蛋白質(zhì)PthXo1，它就必須從細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞[9-12]，這種轉(zhuǎn)運(yùn)過程(translocation)需要病菌T3轉(zhuǎn)位子(translocon)的幫助[9-13,49]。T3轉(zhuǎn)位子由親水性和疏水性蛋白質(zhì)組成，執(zhí)行底物轉(zhuǎn)運(yùn)功能對(duì)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)的一個(gè)基本要求就是，轉(zhuǎn)位子蛋白質(zhì)必須經(jīng)由植物細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和脂類受體的識(shí)別作用，進(jìn)而定位到植物細(xì)胞膜上或插入其中[11,49]。根據(jù)在動(dòng)物病原細(xì)菌上的研究，T3轉(zhuǎn)位子蛋白質(zhì)有三種，但對(duì)植物病原細(xì)菌，迄今還沒有在哪個(gè)種群(種/species、致病變種/pathovar、菌株/strain等)上鑒定出三種轉(zhuǎn)位子蛋白質(zhì)[11,49]。最近，我們發(fā)表了從2003年開始研究Xoo效應(yīng)子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控機(jī)制的部分結(jié)果，證明Xoo的T3分泌系統(tǒng)輔助因子Hpa1蛋白質(zhì)作為疏水性轉(zhuǎn)位子蛋白質(zhì)起作用[12]，幫助病菌效應(yīng)子PthXo1從Xoo細(xì)胞轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞，PthXo1進(jìn)而調(diào)控它的靶標(biāo)基因OsSWEET11表達(dá)，誘發(fā)白葉枯病[9-10]。同其他植物病原細(xì)菌一樣，Xoo還沒有第二個(gè)轉(zhuǎn)位子蛋白質(zhì)得到鑒定。但有研究表明，植物病原細(xì)菌某種T3蛋白質(zhì)如果定位到植物細(xì)胞膜，它就有可能擔(dān)當(dāng)T3轉(zhuǎn)位子組分和毒性/無(wú)毒性效應(yīng)子這種雙重功能[49-50]。根據(jù)XopN定位于植物細(xì)胞膜[48]及其功能的“亞全能性(pluripotent)”，我們推測(cè)，除了毒性效應(yīng)子的作用，XopN還可能擔(dān)當(dāng)T3轉(zhuǎn)位子蛋白質(zhì)的功能。對(duì)此假設(shè)，我們的研究現(xiàn)已接近收官，可望對(duì)XopN的“亞全能性”提供一種解釋。

再看OsSWEET11，研究集中在黃單胞菌致病性與水稻抗病性機(jī)制方面。顯性感病基因Xa13編碼的OsSWEET11/Xa13能與銅轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白質(zhì)COPT1和COPT5合作，調(diào)節(jié)銅離子在植物細(xì)胞間的重新分布，把銅離子移出木質(zhì)部，免除它對(duì)細(xì)菌的毒害，病菌得以繁殖、擴(kuò)展、致病[53]。除了蛋白質(zhì)功能調(diào)控，基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控也有重要作用。顯性感病基因Xa13而非隱性抗病基因xa13的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的“效應(yīng)子結(jié)合元件(effector-binding elements,EBEs)”是PthXo1的靶標(biāo)[41,51]，PthXo1因此可以靶向OsSWEET11/Xa13基因，進(jìn)而發(fā)揮毒性作用[35]。相反，OsSWEET11/xa13啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的EBEs存在突變，拒絕TALEs結(jié)合，導(dǎo)致植物抗病性，這可能是IRBB13對(duì)白葉枯病防衛(wèi)反應(yīng)的一種機(jī)制[32]。

根據(jù)上述XopN與OsSWEET11在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平上的作用機(jī)制，在PXO99A誘導(dǎo)隱性感病基因OsSWEET11/Xa13及其同源基因表達(dá)或抑制顯性感病基因OsSWEET11/xa13表達(dá)的過程中，XopN可能按三種模式參與調(diào)控。1)作為T3轉(zhuǎn)位子蛋白質(zhì)，幫助PthXo1從細(xì)菌細(xì)胞向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，PthXo1隨后按上述機(jī)制發(fā)揮毒性作用，尤其是激活顯性感病基因OsSWEET11/Xa13表達(dá)[41,51]。2)按此方式，EBEs存在突變、拒絕TALEs結(jié)合[32]的隱性抗病基因OsSWEET11/xa13的誘導(dǎo)表達(dá)自然受到抑制。3)XopN具有毒性效應(yīng)子兼T3轉(zhuǎn)位子蛋白質(zhì)的雙重功能，與其他轉(zhuǎn)位子組分(如Hpa1[12])合作，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)，功能靶向PTI[25,48]。對(duì)這三種模式的設(shè)想，需要通過實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。