康維良 ，張東杰 ，翟愛華 ， 王 霞

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319）

綠豆為一年生雙子葉植物的胚，具有極高的食用和藥用價(jià)值[1-2]。綠豆皮一般被加工成飼料，而較少開發(fā)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[3-4]。綠豆皮占綠豆總質(zhì)量的7%～10%。植物化學(xué)研究表明，綠豆皮中含有豐富的黃酮類化合物、喹諾利嗪類生物堿[5-6]、芳基苯并呋喃類等化合物。

近年來藥理研究表明，綠豆皮總黃酮是重要的活性成分，且有抗氧化、消炎、降糖等作用，在營(yíng)養(yǎng)配餐食品中應(yīng)用的越來越廣泛。但黃酮類粗提取物中普遍含有萜類、多糖、蛋白質(zhì)、木脂素等多種雜質(zhì)，嚴(yán)重制約了黃酮類化合物的實(shí)際應(yīng)用[7-8]。因此，開發(fā)一種從綠豆皮中提取高純度黃酮類化合物的有效方法是十分必要的。當(dāng)前有許多草本植物黃酮類化合物的凈化處理方法被開發(fā)出來，如孫曼曼[9]采用酶解耦合雙水液液萃取方式純化菟絲子黃酮最終轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%以上。侯紅瑞等人[10]應(yīng)用制備色譜技術(shù)純化高良姜中黃酮單體化合物，經(jīng)核磁和質(zhì)譜的定性分析，純化效果均達(dá)到70%。蔣紅等人[11]選用凝膠法提純藜蒿中的黃酮化合物，經(jīng)后期定性定量分析，純化效果均達(dá)到預(yù)期要求。以上純化方法由于提純過程中消耗大量有機(jī)溶劑、復(fù)雜的操作和穩(wěn)定性差，分離填料及設(shè)備重復(fù)利用率低，難以應(yīng)用到大批量活性物質(zhì)的純化工作中。而大孔樹脂是一種高效、低成本、環(huán)保、成熟的技術(shù)，能夠滿足工業(yè)生產(chǎn)和無害化生產(chǎn)的需要，被廣泛用于多種活性成分的富集[12-13]，目前樹脂純化技術(shù)應(yīng)用較為廣泛，但多作為黃酮、多糖等天然產(chǎn)物進(jìn)一步分析其結(jié)構(gòu)及組成的前處理手段?，F(xiàn)階段欠缺對(duì)樹脂純化后黃酮純度提高對(duì)應(yīng)的微觀結(jié)構(gòu)變化研究，而確定純化后黃酮的微觀結(jié)構(gòu)變化對(duì)通過改變微觀結(jié)構(gòu)而提高黃酮純度的研究提供一個(gè)新的途徑。

擬對(duì)粗提黃酮類混合物，以AB-8型樹脂為吸附分離純化材料，以單因素確定的純化條件為基礎(chǔ)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化，再通過改進(jìn)吸附和洗脫的技術(shù)參數(shù)，獲得純化較高的黃酮類物質(zhì)；最后通過紅外光譜和掃描電鏡，辨別純化后的黃酮特征曲線及純化前后黃酮的微觀結(jié)構(gòu)變化，以期獲得經(jīng)超聲微波熱法提取黃酮的最佳樹脂純化條件，并探究黃酮微觀結(jié)構(gòu)改變對(duì)黃酮純化效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

綠豆皮提取液粗品，實(shí)驗(yàn)室自制；無水乙醇，分析純，河北百勝化學(xué)制劑有限公司提供；蘆丁，分析純，北京巨邦植物原料有限公司提供；AB-8型大孔吸附樹脂，粒徑范圍0.30～1.25 mm廣東合威新材料有限公司。

1.1.2 設(shè)備

UVZ752型紫外分光光度計(jì)，北京東啟產(chǎn)品；FD-1A-5型冷凍干燥機(jī)，江蘇天翎儀器產(chǎn)品；RE-301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義瑞德儀器產(chǎn)品；TG16-II型離心機(jī)，湖南平凡科技產(chǎn)品；FTIR-850型傅里葉變換紅外光譜儀，天津港東產(chǎn)品；SU7000型掃描電鏡，日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)樣液的制備

根據(jù)前期試驗(yàn)，以優(yōu)化確定的乙醇體積分?jǐn)?shù)61%，料液比1∶31.4（g∶mL），時(shí)間25.8 min，微波功率521 W的超聲-微波協(xié)同萃取條件，獲得的黃酮粗提物，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，置于-50℃凍干機(jī)凍干后測(cè)定純度為29.35%，備用。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線-蘆丁的建立

以亞硝酸鈉-硝酸鋁反應(yīng)法作為測(cè)定依據(jù)，將光度儀波長(zhǎng)設(shè)定為510 nm，和空白試劑進(jìn)行對(duì)比，確定吸光度值，創(chuàng)建平面直角坐標(biāo)系，確定回歸方程[14]。

1.2.3 樹脂動(dòng)態(tài)吸附平衡試驗(yàn)

稱取處理完全的樹脂，按照徑高比1∶10，濕法上柱，上樣條件為黃酮樣液質(zhì)量濃度1 mg/mL，流速2 mL/min，pH值5；洗脫條件為洗脫液95%乙醇，流速2.5 BV/h；以10 mL為基礎(chǔ)采集1管洗脫液，測(cè)其總黃酮質(zhì)量濃度，繪制動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線。

1.2.4 計(jì)算公式

式中：C——黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；

C0——吸附前樣液質(zhì)量濃度，mg/mL；

C1——吸附后樣液質(zhì)量濃度，mg/mL。

V0——上柱前液體體積，mL；

V1——上柱后液體體積，mL；

M——使用樹脂質(zhì)量[15]。

1.2.5 單因素試驗(yàn)篩選樹脂吸附工藝參數(shù)

（1） 最佳樣液質(zhì)量濃度的篩選。固定吸附的pH值4，以2 mL/min的速度，徑高比為1∶10的樹脂層析柱中，以質(zhì)量濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mg/mL為變量，依據(jù)附著量篩選出最佳樣液質(zhì)量濃度。

（2）最佳流速的篩選。固定樹脂吸附的質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL黃酮樣液，pH值4，以1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL/min流速為變量，注入徑高比為1∶10的樹脂層析柱中，依據(jù)附著量篩選取出最佳樣液流速。

（4） 最佳pH值的篩選。將質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，pH值為3.5，4，4.5，5，5.5的樣液以2 mL/min的速度，徑高比為1∶10的樹脂層析柱中，依據(jù)附著量篩選出最佳樣液pH值。

（5） 最佳徑高比篩選。將質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，pH值為4的樣液，以流速為2 mL/min的速度分別注入徑高比為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25的樹脂層析柱中，依據(jù)附著量篩選取出最佳樹脂徑高比。

1.2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化吸附工藝試驗(yàn)

以單因素確定的樹脂最高吸附量的條件樣液質(zhì)量濃度、流速、pH值、樹脂徑高比為基礎(chǔ)水平，通過正交試驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)顯著性分析，對(duì)樹脂吸附效果進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.7 解析工藝條件篩選及洗脫曲線繪制

解析液質(zhì)量濃度及使用量的改進(jìn)，將完成動(dòng)態(tài)吸附的樹脂分別用150 mL體積分?jǐn)?shù)為25%，35%，45%，55%，65%，75%，85%，95%進(jìn)行解析，確定最佳解析液體積分?jǐn)?shù)。將樹脂分別用50，100，150，200，250，300 mL體積分?jǐn)?shù)為55%進(jìn)行解析，確定最佳解析液體積分?jǐn)?shù)。參照1.2.6，1.2.7優(yōu)化參數(shù)，每10 mL采集1管洗脫液，建立以總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL） 與洗脫體積（BV） 洗脫曲線關(guān)系。

1.2.8 傅立葉變換紅外吸收光譜分析

純化液按1.2.1方法凍干后將樣品準(zhǔn)確稱量1 mg，與烘干的KBr混合研磨均勻后，壓片，采用FTIR紅外光譜儀進(jìn)行紅外光譜透射法進(jìn)行掃描。掃描條件參照文獻(xiàn)[16]。

1.2.9 掃描電鏡

取干燥樣品2 g，噴金1 min，后移動(dòng)樣品臺(tái)以觀察干燥后的綠豆皮黃酮粗提物和經(jīng)AB-8型大孔樹脂純化后的樣品顯微結(jié)構(gòu)。掃描電鏡放大倍數(shù)分別為 1 000，2 000，5 000倍，選取清晰完整的圖片進(jìn)行分析[17-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

建立平面直角坐標(biāo)系，其中橫、縱軸分別代表蘆丁質(zhì)量濃度以及吸光度，完成線性回歸后，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：R=10.386X-0.015 9，R2=0.998。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.2 動(dòng)態(tài)泄露吸附曲線

樹脂動(dòng)態(tài)泄露曲線見圖2。

由圖2可知，流出液體積60 mL時(shí)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，出現(xiàn)泄露現(xiàn)象此時(shí)流出液中黃酮類化合物質(zhì)量濃度為0.13 mg/mL。當(dāng)流出液體積達(dá)到85 mL時(shí)，為大孔吸附樹脂的泄露點(diǎn)，流出液體積達(dá)到120 mL時(shí)，綠豆皮總黃酮質(zhì)量濃度已非常接近原料液中綠豆皮總黃酮的質(zhì)量濃度，說明此時(shí)AB-8型大孔樹脂已趨于飽和吸附，最大上樣量不能超過120 mL。

2.3 單因素試驗(yàn)篩選結(jié)果

2.3.1 最佳樣液質(zhì)量濃度的篩選

樣液質(zhì)量濃度與樹脂吸附量的關(guān)系見圖3。

由圖3可知，吸附量隨樣品質(zhì)量濃度上升呈先升高后回落的狀態(tài)，在樣液質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)樹脂吸附量達(dá)到最大值為17.31 mg/g，后吸附量隨質(zhì)量濃度提高而降低。這是因?yàn)樘崛∫褐泻幸欢s質(zhì)，質(zhì)量濃度超過一定值后，雜質(zhì)含量增多，堵塞在樹脂空隙，減小了樹脂與純化液接觸的比表面，影響樹脂吸附效果。雜質(zhì)的積累也會(huì)造成樹脂的機(jī)械強(qiáng)度下降，增加流體阻力，阻礙樹脂再生和重復(fù)利用。當(dāng)樣液質(zhì)量濃度未達(dá)到平衡點(diǎn)前，由于樹脂的多孔隙結(jié)構(gòu)的吸附特性的存在，當(dāng)純化液中黃酮類物質(zhì)的含量上升時(shí)，吸附量也隨之增大[19]。因此選擇最佳質(zhì)量濃度為1 mg/mL。

2.3.2 最佳流速的篩選

樣液流速與吸附量的關(guān)系見圖4。

由圖4可知，樹脂吸附量是隨著流速的升高而逐漸下降。這是因?yàn)殡S流速的升高，大孔樹脂與黃酮樣液接觸時(shí)間也隨之減少，黃酮類物質(zhì)不能完全被吸附上。當(dāng)上樣流速過慢，目標(biāo)物與樹脂接觸越充分，從而提高大孔樹脂的吸附量，但會(huì)降低吸附效率[20]，因此在不影響吸附效率的情況下選取適宜的上樣流速十分重要。由圖4可知，樹脂吸附量在流速為1 mL/min時(shí)樹脂吸附量達(dá)到最大值，但由于該流速下試驗(yàn)周期太長(zhǎng)，為最佳吸附流速。故選擇吸附量相近的1.5 mL/min。

2.3.3 最佳pH值的篩選

pH值與吸附量的關(guān)系見圖5。

由圖5可知，樹脂吸附量隨pH值上升而升高，pH值達(dá)到5時(shí)吸附量達(dá)到最大值為17.54 mg/g，這是由于黃酮類化合物在偏酸性條件下黃酮分解酶被抑制，黃酮類化合物多數(shù)為游離狀態(tài)，易被具有氫鍵受體特性的樹脂所截獲[21]。偏酸性環(huán)境還可以提高樹脂的鍵合能力和親脂鍵、偶極離子結(jié)合能力，提升吸附效果。但隨著pH值上升，黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)則會(huì)發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化為鹽類物質(zhì)，阻礙樹脂吸附。故選擇最適pH值為5。

2.3.4 最佳徑高比的篩選

層析柱的徑高比與吸附量的關(guān)系見圖6。

由圖6可知，大孔樹脂徑高比和吸附量有著極佳的線性關(guān)系，隨著樹脂徑高比的提高，黃酮吸附量液隨之增加。因?yàn)槲搅颗c吸附面積呈正相關(guān)，想要獲取高的吸附量，則應(yīng)選擇徑高比大的吸附參數(shù)[22]。從節(jié)省材料和最適吸附率角度考慮，在徑高比為1∶20時(shí)接近最大吸附量，但考慮試驗(yàn)周期及可行性。選擇徑高比1∶15為最佳徑高比，這是因?yàn)殡S著樹脂徑高比的增加，黃酮溶液與樹脂的吸附面積增大，吸附的更加充分。

2.4 正交試驗(yàn)法改良AB-8型大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附工藝技術(shù)

考慮到不同因素彼此間存在一定的影響，為了準(zhǔn)確找到最佳工藝條件。接下來針對(duì)樣液質(zhì)量濃度、流速、pH值、徑高比這4個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。正交設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 正交設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表1可知，最佳組合條件為A2B2C2D3，即是樣液質(zhì)量濃度1 mg/mL，流速為2 mL/min，pH值為5，徑高比為1∶15，優(yōu)化后樹脂吸附量達(dá)到24.38 mg/g。按照因素和提取率關(guān)聯(lián)性從高到低排序依次是樣液質(zhì)量濃度＞徑高比＞流速＞pH值，由此可見，對(duì)提取率影響最突出的因素為樣液質(zhì)量濃度。

純化條件方差分析見表2，不同樣液質(zhì)量濃度多重比較（LSD）見表3，不同樣液質(zhì)量濃度多重比較（鄧肯） 見表4。

表2 純化條件方差分析

表3 不同樣液質(zhì)量濃度多重比較（LSD）

方差及多重比較分析結(jié)果表明，樣液質(zhì)量濃度的處理因素間F值差異顯著（sig=0.024＜0.05），說明樣液質(zhì)量濃度對(duì)黃酮吸附量有顯著影響。其他各因素的F值差異不顯著（sig＞0.05），說明樣液質(zhì)量濃度是最重要的控制條件。通過進(jìn)一步對(duì)顯著性因素樣液質(zhì)量濃度通過LSD檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，優(yōu)化最佳的樣液質(zhì)量濃度參數(shù)。由多重比較結(jié)果可知，A2（1 mg/mL） 與A1（0.5 mg/mL） 水平間差異顯著，A3（1.5 mg/mL） 與A2（1 mg/mL）、A1（0.5 mg/mL）間都不存在顯著性。因此，通過對(duì)顯著性因素樣液質(zhì)量濃度水平間的多重比較，最終的純化條件組合還是A2B1C2D3。

表4 不同樣液質(zhì)量濃度多重比較（鄧肯）

2.5 最優(yōu)解析技術(shù)篩選

吸附樹脂解析過程中，解析液的質(zhì)量濃度和添加量是影響解析效果的重要因素，故試驗(yàn)對(duì)上述2個(gè)因素分別進(jìn)行單因素優(yōu)化，以期篩選出最佳的解析條件[23]。

乙醇體積分?jǐn)?shù)和使用量與解析率的關(guān)系見圖7。

由圖7可知，樹脂解析率隨解析液質(zhì)量濃度和用量的增多而提高，通過單因素試驗(yàn)篩選及試驗(yàn)便利方面考慮最佳乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%，洗脫劑解析液最佳用量為170 mL。這是因?yàn)楦鶕?jù)極性溶劑相似相溶原理，隨著洗脫劑解析液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，溶劑的極性隨著降低，黃酮也更易被洗脫解析下來。乙醇體積的增加則會(huì)提高樹脂振蕩解析過程中樹脂與乙醇的接觸效果，使洗脫解析更充分。

2.6 動(dòng)態(tài)洗脫試驗(yàn)

洗脫曲線見圖8。

動(dòng)態(tài)洗脫試驗(yàn)是確定解析液用量的關(guān)鍵步驟，適量的解析液可以達(dá)到節(jié)省試劑和縮短試驗(yàn)周期的目的。由圖8可知，洗脫劑用量為23 mL時(shí)，黃酮就被洗脫下來，當(dāng)洗脫劑用量達(dá)到16 mL，黃酮洗脫量達(dá)到峰值；當(dāng)洗脫劑用量24 mL，樹脂所吸附的黃酮基本被洗脫下了。洗脫曲線峰型尖銳峰面積小，無拖尾現(xiàn)象說明黃酮類物質(zhì)洗脫集中，洗脫效果佳，經(jīng)最優(yōu)條件純化后的黃酮純度為72.38%。

2.7 傅立葉變換紅外吸收光譜分析

通過傅里葉變化光譜對(duì)綠豆皮純化液進(jìn)行定性分析，確定純化液中的活性物質(zhì)為黃酮類化合物。

FTIR掃描圖見圖9。

由圖9可知，通過大孔樹脂AB-8型純化的綠豆皮黃酮經(jīng)紅外光譜掃描具有了黃酮類物質(zhì)的特征官能團(tuán)：在波數(shù)3 386 cm-1處的吸收峰證實(shí)了羥基的存在。根據(jù)苯環(huán)的不飽和性質(zhì)進(jìn)一步分析譜圖波數(shù)2 926 cm-1處，可知在苯環(huán)交替處產(chǎn)生了C-H，為亞甲基伸縮振動(dòng)峰；波數(shù)1 613 cm-1是由于芳酮羰基伸縮振動(dòng)所引起的特征吸收峰，為黃酮類化合物官能團(tuán)C=O；波數(shù)1 613、1 517 cm-1和1 448 cm-1為苯環(huán)中的C=C振動(dòng)特征吸收峰；波數(shù)1 200～1 050 cm-1的吸收峰為酚羥基的C-O特征峰；波數(shù)837 cm-1為芳香環(huán)中的振動(dòng)特征吸收峰，依據(jù)酮基結(jié)構(gòu)分析可知為酮基鄰位不飽和碳構(gòu)成C=C-H，根據(jù)以上特征峰和分析可知，本試驗(yàn)純化物分子式為C15H9O2為黃酮類化合物母環(huán)[24]。

2.8 掃描電鏡

純化前后掃描電鏡圖見圖10。

由紅外光譜試驗(yàn)，可知該純化物為黃酮類化合物。從圖10可知純化前的黃酮提取物中呈片狀和顆粒狀，但仍有大量物質(zhì)被包裹，黏附在一起。經(jīng)樹脂純化后的黃酮類化合物微觀結(jié)構(gòu)多呈棉絮狀，大量顆粒物質(zhì)被釋放[25]。綠豆皮經(jīng)超聲、微波的穿透和空化的形成了微波場(chǎng)生物效應(yīng)和熱效應(yīng)，促進(jìn)綠豆皮內(nèi)分子間的擠壓、碰撞，從而使片狀包裹黃酮呈絮狀釋放，與學(xué)者李俠雙酶法提取黃酮的純化物比較更高的提取溫度使包裹黃酮的片狀結(jié)構(gòu)充分打開，更多黃酮大量釋放，微波和超聲的協(xié)同作用也大大提高了分子間相互作用，使黃酮在電鏡下呈現(xiàn)大簇的棉絮狀，結(jié)合相關(guān)報(bào)道驗(yàn)證這可能是黃酮純度提升的主要因素之一。

3 結(jié)論

通過正交試驗(yàn)優(yōu)化的AB-8型大孔吸附樹脂純化綠豆黃酮的最佳工藝條件是樣液質(zhì)量濃度為1 mg/mL，流速為2 mL/min，pH值為5，徑高比為1∶15，此時(shí)樹脂吸附量達(dá)到最大值為24.38 mg/g，較優(yōu)化前純度提高44.03%。通過傅里葉近紅外光譜對(duì)純化物進(jìn)行了定性鑒定，確定為黃酮類化合物；使用掃描電鏡從微觀結(jié)構(gòu)確定了黃酮純度提高的原因主要是包裹黃酮的片狀結(jié)構(gòu)被打開。試驗(yàn)以樹脂吸附和解析相結(jié)合的方式研究了純化工藝參數(shù)的優(yōu)化方式，完善了大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)解析和吸附的工藝參數(shù)，為提高樹脂工業(yè)化純化效果提供了理論支持。