龔 旻 伊慶同 朱汝健 張?jiān)c 劉 東

上海市浦東醫(yī)院，復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院泌尿外科（上海 201399）

慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛綜合征（chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndromes，CP/CPPS） 和勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）均是成年男子的常見(jiàn)病和多發(fā)病，嚴(yán)重困擾患者身心健康并影響生活質(zhì)量[1,2]。國(guó)際上CP/CPPS 的臨床癥狀評(píng)估采用UPOINT表型分類(lèi)系統(tǒng)，有學(xué)者建議將性功能障礙（主要是陰莖勃起功能障礙）做為第7 個(gè)癥狀，組成UPOINTS 系統(tǒng)[3]。很多流行病學(xué)研究證實(shí)CP/CPPS 與ED 密切相關(guān)[4-6]。CP/CPPS 是否可以導(dǎo)致ED 及其具體作用機(jī)制尚未闡明。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性前列腺炎（experimental autoimmune prostatitis,EAP） 大鼠模型是研究CP/CPPS 最常用的模型[7]。EAP 大鼠可以引起前列腺特異性自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)前列腺組織，與臨床CP/CPPS疾病發(fā)展過(guò)程相似[8,9]。我們通過(guò)構(gòu)建大鼠EAP 模型，探討EAP 大鼠的陰莖勃起功能情況，以期進(jìn)一步闡明EAP 導(dǎo)致ED 可能的發(fā)生機(jī)制。

材 料

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠30 只[購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證編號(hào)：20130016005371，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批號(hào)：（2017）倫理審字（QWJWXKJS-15）號(hào)]，體重120g-140g。飼養(yǎng)條件：室溫22 ℃，濕度50%-60%，12h 明暗交替。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，利用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10 只。另10 只大鼠用于制備前列腺組織蛋白提純液。

二、主要試劑

完全弗氏佐劑（F5881）購(gòu)自Sigma 公司，無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗（批號(hào)201712082-1）購(gòu)自武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，TNF-α ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoScientific 公司，IL-1βELISA 試劑盒(EK301B2/2)購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，F(xiàn)as（ab82419）及FasL （ab15285） 抗體購(gòu)自Abcam 公司，β-actin 抗體（GB11001）、masson 染液套裝（G1006）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司，丙二醛測(cè)試盒（A003-1）及總超氧化物歧化酶測(cè)試盒（A001-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所，TUNEL 試劑盒（11684817910）購(gòu)自Roche 公司。

方 法

一、前列腺組織蛋白提純液制備及EAP 大鼠模型建立

參照葉偉成等人的方法[10]，采用免疫佐劑法制作大鼠EAP 模型。制備前列腺組織蛋白提純液：取10 只大鼠，3%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)麻醉，進(jìn)入腹腔，在無(wú)菌條件下取出大鼠前列腺組織。用冰生理鹽水浸洗，剔除脂肪組織，剪碎前列腺組織后放入玻璃勻漿器中勻漿。最后將勻漿液放入離心管中，12000rpm，4℃，離心30min，用吸管吸去上層脂肪組織，再吸取上清液。采用BCA 法測(cè)定前列腺勻漿液蛋白濃度，最后稀釋成濃度為20mg/ml，分裝后放入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)組分別于實(shí)驗(yàn)第1d、第7d 采用多點(diǎn)皮內(nèi)注射大鼠前列腺組織蛋白提純液與完全弗氏佐劑（等比混勻）共1mL：腳掌0.1ml×2 只，腹股溝0.4mL，頸部0.4mL，同時(shí)腹腔注射百白破疫苗0.5mL，第21d 腹腔注射大鼠前列腺組織蛋白提純液0.5mL，對(duì)照組在相同的時(shí)間和部位注射相同體積的生理鹽水。

二、大鼠最大陰莖海綿體壓力（Max ICP）及勁動(dòng)脈壓力檢測(cè)

第35d, 參照Chen[11]及吳子云[12]等人的方法，大鼠腹腔注射麻醉后取下腹正中切口，尋找并分離大鼠盆腔內(nèi)海綿體神經(jīng)，沿陰莖根部游離、 切斷坐骨海綿體肌，暴露陰莖腳。用磨成倒刺狀的頭皮針刺入陰莖腳，連接傳感器，打開(kāi)生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集系統(tǒng)(PCLAB-UE)，設(shè)置好實(shí)驗(yàn)采樣參數(shù)及刺激參數(shù)（波寬0.5ms，電壓4V，脈沖15 次/s，持續(xù)時(shí)間50s），雙鉤電極刺激陰莖海綿體神經(jīng)，進(jìn)行ICP 測(cè)定。同時(shí)分離大鼠勁動(dòng)脈，穿刺插管測(cè)壓。平均動(dòng)脈血壓（MAP）=舒張壓+1/3 收縮壓。

三、標(biāo)本的采集

第35d 測(cè)完Max ICP 及MAP 后，取兩組大鼠的前列腺組織及陰莖組織，仔細(xì)剪除附著的脂肪組織和筋膜，冷生理鹽水沖洗后以濾紙拭干。前列腺組織及一部分陰莖組織用多聚甲醛液固定，逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度4μm。另一部分陰莖組織放入液氮中冷凍備用。采集大鼠腹主動(dòng)脈血2ml，離心后取上清，放入-80℃?zhèn)溆谩?/p>

四、前列腺組織HE 染色及血清中炎癥因子TNF-α及IL-1β 水平檢測(cè)

前列腺組織切片常規(guī)脫蠟、 復(fù)水，蘇木精染色15min—自來(lái)水沖洗1min—1%鹽酸酒精分化20 秒—自來(lái)水沖洗3min—伊紅染色5min—自來(lái)水沖洗3min。最后脫水、透明、封固，組織切片掃描儀掃描后觀(guān)察。血清中炎癥因子TNF-α 及IL-1β 水平的檢測(cè)嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每個(gè)血樣重復(fù)三次，取平均值作為最終結(jié)果。

五、陰莖組織中超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平檢測(cè)

稱(chēng)適量液氮凍存陰莖組織，用9 倍體積的蒸餾水勻漿研磨，然后將研磨液3000rpm，離心10min，取上清制備成10%的組織勻漿。用BCA 法測(cè)陰莖勻漿組織蛋白濃度。然后嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定陰莖勻漿組織SOD 活力與MDA 水平。

六、陰莖組織中凋亡因子Fas/FasL 蛋白表達(dá)水平

提取陰莖組織總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，取20μg 的蛋白上樣，進(jìn)行8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。用封閉液（5%脫脂奶粉的TBS-T）室溫封閉1 h。用TBS-T 洗膜后分別孵育Fas、FasL 及β-actin 抗體，4 ℃過(guò)夜。次日TBS-T 洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。最后TBS-T 洗膜后ECL 化學(xué)發(fā)光顯影。條帶用Alpha 分析軟件進(jìn)行灰度分析。

七、陰莖組織熒光TUNEL

陰莖組織石蠟切片脫蠟至水，然后滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37℃溫箱孵育25min；PBS 洗滌3 次，每次5min； 滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min；PBS 洗滌3 次，每次5min； 滴加試劑盒內(nèi)TdT和dUTP 混合液（1:9），37℃恒溫箱孵育2h；PBS 洗滌3次，每次5min；滴加DAPI 染液，避光室溫孵育10min；PBS 洗滌3 次，每次5min；用抗熒光淬滅封片劑封片。最后切片于熒光顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。每個(gè)切片隨機(jī)選取4 個(gè)視野，使用IPP 軟件計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)與正常細(xì)胞數(shù)，最后計(jì)算凋亡指數(shù)(AI) ，AI＝凋亡細(xì)胞數(shù)／(凋亡細(xì)胞數(shù)＋正常細(xì)胞數(shù))。

八、陰莖組織Masson 染色

陰莖組織石蠟切片脫蠟至水，然后切片入重鉻酸鉀浸泡過(guò)夜； 切片入鐵蘇木素3min，鹽酸酒精溶液分化；切片入麗春紅酸性品紅浸染5min；磷鉬酸水溶液浸染1min；苯胺藍(lán)染液染3min；切片用1%冰醋酸分化，無(wú)水乙醇脫水；最后二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析，使用IPP 軟件計(jì)算陰莖海綿體平滑肌與膠原面積比值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、陰莖勃起功能評(píng)價(jià)

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠陰莖Max ICP 分別為(96.56±2.251)mmHg、(62.71±2.126)mmHg，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組平均動(dòng)脈壓（MAP）分別為(129.33±2.214)mmHg、(123.85±4.396)mmHg，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.280）。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組Max ICP/MAP 比值分別為(0.747±0.013)、(0.514±0.028)，兩組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

二、前列腺組織HE 染色及血清中TNF-α 及IL-1β水平

HE 染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組前列腺組織不均勻增生，部分基底膜破壞，慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)間質(zhì)、腺泡及腺泡周?chē)M織；而對(duì)照組前列腺上皮結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)組織水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）。實(shí)驗(yàn)組大鼠血清TNF-α 水平明顯高于對(duì)照組[(17.75±1.96) pg/ml vs (11.83±1.94)pg/ml]，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039)。實(shí)驗(yàn)組大鼠血清IL-1β 水平明顯高于對(duì)照組[(225.8±61.04)pg/mL vs (88.71±18.15) pg/mL]，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041）。

三、陰莖組織中SOD 及MDA 水平檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組大鼠陰莖組織中超氧化物歧化酶水平明顯低 于 對(duì) 照組 [(98.36±3.795) U/mg vs (118.2±3.275)U/mg]，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。實(shí)驗(yàn)組大鼠陰莖組織中丙二醛水平明顯高于對(duì)照組[(1.381±0.167)nmol/mg vs(0.941±0.096)nmol/mg，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037）。

四、 陰莖組織中凋亡因子Fas、FasL 蛋白的表達(dá)水平及熒光TUNEL

實(shí)驗(yàn)組大鼠陰莖組織中Fas 及FasL 蛋白的表達(dá)水平分別為（0.353±0.076）、（0.334±0.028），對(duì)照組分別為（0.107±0.013）、（0.201±0.023），兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P 值分別為0.019、0.010）（圖2）。陰莖組織熒光TUNEL，可見(jiàn)DAPI 染色的細(xì)胞核，箭頭所示為凋亡細(xì)胞核（圖3）。定量分析發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的凋亡指數(shù)分別為15.93%、4.74%，兩組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

五、陰莖海綿體平滑肌與膠原面積比值

陰莖組織Masson 染色中三角形所示為平滑肌組織，箭頭所示為膠原（圖4）。大鼠陰莖海綿體平滑肌與膠原面積比值分別為8.28%、24.11%，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)。

圖1 前列腺組織HE 染色

圖2 陰莖組織中凋亡因子Fas 及FasL 蛋白的表達(dá)水平

圖3 陰莖組織熒光TUNEL

圖4 陰莖組織Masson 染色（×200）

討 論

CP/CPPS 患者除了排尿異常及疼痛不適癥狀外，通常還伴有ED[13]，給患者造成極大困擾，嚴(yán)重危害男性身心健康，耗費(fèi)巨大醫(yī)療資源。眾多的流行病學(xué)調(diào)查顯示CP/CPPS 是ED 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5,14]。有臨床研究證實(shí)單純治療慢性前列腺炎可明顯改善大多數(shù)患者并發(fā)的ED 癥狀[15]。CP/CPPS 患者血管內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈硬化風(fēng)險(xiǎn)更高，這可能是CP/CPPS 增加ED危險(xiǎn)因素的重要機(jī)制之一[16]。同時(shí)，CP/CPPS 患者往往伴有抑郁或焦慮，這些心理問(wèn)題可能會(huì)降低陰莖勃起功能。內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)因素也可能與CP/ CPPS患者ED 發(fā)病有關(guān)[17]。CP/CPPS 能否導(dǎo)致ED 及其確切的作用機(jī)制還存在很多爭(zhēng)議。因此，我們構(gòu)建了大鼠EAP 模型，以模擬臨床CP/CPPS，探討EAP 對(duì)陰莖勃起功能的影響。

本研究成功構(gòu)建了大鼠EAP 模型，HE 染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組前列腺組織不均勻增生，部分基底膜破壞，慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)間質(zhì)、腺泡及腺泡周?chē)M織；而對(duì)照組前列腺上皮結(jié)構(gòu)完整，沒(méi)有組織水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。我們通過(guò)測(cè)定大鼠最大陰莖海綿體壓力及平均動(dòng)脈壓的比值（MaxICP/MAP），發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組MaxICP/MAP 明顯低于對(duì)照組，證實(shí)了EAP 大鼠可能存在ED。電刺激大鼠的陰莖海綿體神經(jīng)可有效的模擬其生理性勃起，勃起后的檢測(cè)到的壓力即為ICP，ICP 可客觀(guān)、 有效地反應(yīng)大鼠的勃起功能[18]。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中TNF-α 及IL-1β 水平均高于對(duì)照組。炎癥在ED的病理生理中起到了重要作用，已有研究證實(shí)ED 患者血液中的炎癥因子水平明顯高于正常對(duì)照，且與性表現(xiàn)呈負(fù)相關(guān)[19]。炎癥因子的釋放導(dǎo)致陰莖海綿體內(nèi)皮功能受損，最終導(dǎo)致陰莖血管粥樣硬化病變，引起ED[20]。

氧化應(yīng)激方面，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠陰莖組織中SOD 水平低于對(duì)照組，而MDA 水平高于對(duì)照組。SOD是一種能夠催化超氧化物的酶，是一種重要的抗氧化劑，SOD 可清除活性氧，保護(hù)生物膜免受自由基的損害。MDA 是膜脂質(zhì)過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，可引起細(xì)胞毒性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組SOD 較少而MDA 增多，說(shuō)明EAP 大鼠陰莖組織氧化應(yīng)激加劇、 抗氧化能力水平下降，導(dǎo)致MDA 蓄積，最終導(dǎo)致陰莖組織氧化損傷[21]。有研究表明糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激加劇，引起陰莖組織凋亡增加，導(dǎo)致勃起功能障礙，而使用強(qiáng)效抗氧化劑后，勃起功能改善[22]。凋亡方面，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠陰莖組織中Fas 及FasL 蛋白的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，且陰莖組織熒光TUNEL 證實(shí)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡指數(shù)（15.93%）明顯高于對(duì)照組（4.74%）。Fas/FasL 是最重要的凋亡通路之一，F(xiàn)asL 與Fas 結(jié)合后可以激活細(xì)胞凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成凋亡復(fù)合體，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[23]。EAP 大鼠Fas/FasL 凋亡通路激活，陰莖組織凋亡過(guò)多，影響其功能。

正常陰莖海綿體由結(jié)締組織和平滑肌組成，兩者保持一定的比例，是勃起過(guò)程中維持有效靜脈關(guān)閉機(jī)制的基礎(chǔ)。ED 患者陰莖組織主要病理變化是結(jié)締組織的增加和平滑肌細(xì)胞的萎縮及凋亡[24]。有研究表明陰莖長(zhǎng)期暴露于氧化應(yīng)激的狀態(tài)下，可誘導(dǎo)一系列組織的慢性炎癥和纖維化，組織學(xué)表現(xiàn)為大鼠陰莖海綿體組織中平滑肌與膠原面積比值下降[25-27]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)大鼠陰莖組織氧化應(yīng)激加劇，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組大鼠陰莖海綿體平滑肌與膠原面積比值（8.28%）明顯低于對(duì)照組（24.11%）。陰莖組織纖維化可降低陰莖的韌性與順應(yīng)性，最終導(dǎo)致ED。

本研究證實(shí)EAP 大鼠存在血清中炎癥因子升高、陰莖組織氧化應(yīng)激加劇、凋亡增加、平滑肌與膠原面積比值下降，陰莖海綿體壓力下降。這些因素可能共同導(dǎo)致陰莖組織結(jié)構(gòu)與功能受損，從而可能引起ED。本研究有望為臨床治療CP/CPPS 導(dǎo)致的ED 患者提供新思路及策略。本研究是一項(xiàng)初步動(dòng)物研究，尚不能完全反映CP/CPPS 伴發(fā)ED 患者的病理生理、 性功能及心理狀態(tài)變化，需要進(jìn)一步的研究證據(jù)來(lái)明確CP/CPPS 和ED 之間的關(guān)系。