羅建勇，史一白，劉澤瑾，吳晨孛，錢 芳，，郭 峰，黃立新

（1.廣州雙橋股份有限公司，廣東廣州 510280；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

木瓜蛋白酶是由212個(gè)氨基酸單元組成的巰基蛋白酶，具有較寬的底物特異性；分子量約23 400，等電點(diǎn)8.75，最適pH值6～7，最適溫度55～65℃，耐熱性強(qiáng)，在90℃時(shí)也不完全失活；受氧化劑抑制，還原性物質(zhì)激活。木瓜蛋白酶商品是由番木瓜（Carica papya L.）的果汁和葉子分離而得的蛋白酶混合物的酶制劑，包含蛋白酶、凝乳蛋白酶、溶菌酶等，多呈淡褐色無定形粉末或顆粒，微吸濕，微有硫化氫臭味[1]，在國內(nèi)有廣泛的來源。

木瓜蛋白酶具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等優(yōu)點(diǎn)，即使在食品領(lǐng)域，應(yīng)用也非常廣，比如用于酶解動(dòng)物蛋白[2-5]，以及花生[6]、玉米[7]、核桃[8]、米糠[9]和大豆[10-14]等的植物蛋白，用于改性蛋白，作為保健和藥物功能配料，都具有非常好的效果。

在前期研究基礎(chǔ)上，采用木瓜蛋白酶在不同的水解條件下酶解大豆蛋白，研究測定其大豆蛋白酶解液的蛋白質(zhì)回收率、水解度、隆?。↙undin）區(qū)分變化及SDS-PAGE凝膠電泳，探討水解制備大豆蛋白酶解發(fā)酵液的條件，使之接近或者相當(dāng)于麥芽汁隆丁區(qū)分的一般要求：高分子含氮物質(zhì)占25%，中分子含氮物質(zhì)占15%，低分子含氮物質(zhì)占60%，有豐富的有機(jī)氮元素和良好風(fēng)味，作為發(fā)酵的氮源與啤酒用麥芽糖漿復(fù)配使用，能夠更適于啤酒的釀造。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆蛋白，山東香馳豆業(yè)科技有限公司提供；木瓜蛋白酶（酶活力60萬U/g），廣州日日香酶制劑有限公司提供。

三氯乙酸、高嶺土、濃硫酸、濃鹽酸等試劑，均為分析純；無水碳酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀為基準(zhǔn)純；L-酪氨酸、甘氨酸、干酪素為生化試劑；丙烯酰氨、N,N'-甲叉雙丙烯酰氨、三羥甲基氨基甲烷Tris、四甲基乙二胺TEMED、考馬斯亮藍(lán)R-250、十二烷基硫酸鈉和電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品都為電泳純。

根據(jù)待測蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的大小，選擇相對(duì)分子質(zhì)量在6 200～66 200 Da的Marker標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品各組分成分見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品各組分成分

1.2 儀器設(shè)備

PHS-3C型pH計(jì)、FA1004電子分析天平、KHW-D-1型電熱恒溫水浴渦、79-3型恒溫磁力攪拌器、JJ-1型增力電動(dòng)攪拌器、KDN-2C型凱氏定氮儀、KDN型消化爐、TDL-5-A型低速臺(tái)式離心機(jī)、DYCG-30型電泳槽等。

1.3 大豆蛋白酶解液的制備

1.3.1 步驟

準(zhǔn)確稱量大豆蛋白，加入一定量蒸餾水，攪拌均勻，在80±2℃條件下處理15 min，冷卻至預(yù)定溫度后恒溫水浴，調(diào)節(jié)pH值至設(shè)定值。加入一定量的酶粉（液），配制成設(shè)定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的反應(yīng)液，緩慢攪拌，反應(yīng)過程用濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液滴定維持體系在預(yù)定的pH值。反應(yīng)到預(yù)定時(shí)間后，立即放入85℃或100℃水浴中加熱15 min鈍化蛋白酶，冷卻后以轉(zhuǎn)速4 800 r/min離心20 min，取上清液，置于冰箱冷藏。采用pH-state法測定大豆蛋白酶解過程的水解度[15]。

1.3.2 裝置圖

制備大豆蛋白酶解液的試驗(yàn)裝置簡圖見圖1。

1.4 測定方法

1.4.1 干固物[16]

1.4.2 蛋白質(zhì)

參照GB 5009.5標(biāo)準(zhǔn)檢測測定，換算系數(shù)為5.71。

1.4.3 可溶蛋白質(zhì)回收率（NR）

大豆蛋白原料酶解后，稱量酶解離心后上清液的質(zhì)量，準(zhǔn)確稱取約1.000 g的蛋白酶解液，用凱氏定氮法消化、定氮，測定上清液中蛋白質(zhì)含量，為：

1.4.4 α-氨基氮含量[17]

1.4.5 隆丁區(qū)分的測定[17]

1.4.6 SDS-PAGE凝膠電泳[18]

標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣和未知樣品在同一塊凝膠上進(jìn)行電泳，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)作圖，可以獲得一條mR-lgMr標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知蛋白的遷移率，可得到未知樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶用量對(duì)大豆蛋白水解產(chǎn)物的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，酶解溫度60℃，pH值6.0，酶用量分別在6 000，8 000，10 000 U/g下進(jìn)行酶解。隨著酶解的進(jìn)行，pH值逐漸下降，過程滴加濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH值在6.0。取不同時(shí)間段的酶解液，測量其NR、DH，以及酶解液Lundin分布和電泳后的分子量分布。

酶用量對(duì)可溶蛋白回收率和水解度的影響見圖2，酶用量對(duì)Lundin A、B和C區(qū)分分布的影響見圖3，酶用量隨反應(yīng)時(shí)間變化所得酶解液的SDS-PAGE凝膠圖譜見圖4。

由圖2可見，酶用量對(duì)NR、DH的影響很大。酶解初期DH增加很快，反應(yīng)60～80 min后逐漸停滯，酶用量越高，快速酶解期越長，可達(dá)到的DH越大。酶解1～3 h，NR隨酶解時(shí)間增長而增大，隨后輕微變小，應(yīng)該是酶解后期體系中小多肽數(shù)量濃度增大，自聚導(dǎo)致NR有所減小。

由圖3可見，木瓜蛋白酶的單位用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Alcalase、Protamex 2種蛋白酶，但是對(duì)大豆蛋白的酶解效果不如它們，其A、B區(qū)分的含量比例在相同的水解時(shí)間下，較前2種的酶解液多，與酶的酶解特性有關(guān)。Alcalase為微生物來源的蛋白酶，其中含有堿肽酶，其酶解的特異性較寬，對(duì)蛋白質(zhì)酶解效果往往優(yōu)于植物來源的琉基蛋白酶——木瓜蛋白酶。隨著酶用量和酶解時(shí)間的增加，A區(qū)分的含量比例迅速變少，然后逐漸變?。?～6 h時(shí)，此時(shí)A區(qū)分的含量都較為接近，約10%，屬于較難于再被木瓜蛋白酶水解的高分子的部分。C區(qū)分在酶解2 h之后，其含量比例都超過60%，酶解6 h，甚至70%～80%。

2.4 療效評(píng)估 患者應(yīng)當(dāng)在拔除尿管之后的4～6周復(fù)診，以評(píng)價(jià)治療反應(yīng)和不良事件。如果患者的癥狀得以緩解且無不良事件，則沒有必要進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。在4～6周后隨訪時(shí)建議進(jìn)行以下檢測：IPSS、QOL、尿流率和殘余尿測定。

隨著酶用量和酶解時(shí)間的增加，B區(qū)分的含量變化顯示一定的規(guī)律。酶用量6 000 U/g時(shí)，1～2 h階段，B區(qū)分含量接近約23%，4 h時(shí)降至17.5%，6 h時(shí)又升高到19%，B區(qū)分保持相對(duì)高的含量。酶用量為8 000 U/g時(shí)，B區(qū)分的含量隨酶解時(shí)間的增加總體呈下降趨勢，但在2～4 h階段，其B區(qū)分含量接近約13%，6 h時(shí)又下降到11%。酶用量為10 000 U/g時(shí)，B區(qū)分的含量隨著酶解時(shí)間的增加也呈下降的趨勢，但在4～6 h階段，B區(qū)分的含量已經(jīng)下降到趨于穩(wěn)定，約為10.5%。

由圖4可見，在反應(yīng)1 h時(shí)，隨著酶用量的增加，酶解液中的分子量分布，由6 000 U/g時(shí)分子量最大的接近43 000 Da，變?yōu)? 000 U/g時(shí)的31 000 Da左右。

酶用量為10 000 U/g時(shí)，與8 000 U/g時(shí)比較相近。當(dāng)反應(yīng)至2 h后，分子量約31 000 Da的蛋白質(zhì)幾乎不存在。由此可見，為了得到適合分子量分布的酶解液，同時(shí)考慮NR、DH等經(jīng)濟(jì)因素，選擇酶用量為8 000 U/g較為適合。從B區(qū)分分布上也可見，在酶用量為8 000 U/g時(shí)，可以得到中分子量蛋白（12 000～40 000 Da） 含量在15%左右。

2.2 酶解pH值對(duì)大豆蛋白酶解產(chǎn)物的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，反應(yīng)溫度60℃，酶用量8 000 U/g，pH值分別在5.0，6.0，7.0下進(jìn)行酶解，過程滴加濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH值在6.0。取不同時(shí)間段的酶解液，測量其NR、DH，以及酶解液Lundin分布和電泳后的分子量分布。

酶解pH值對(duì)蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響見圖5，酶解pH值對(duì)Lundin A、B和C區(qū)分分布的影響見圖6，不同pH值條件下隨反應(yīng)時(shí)間所得的酶解液的SDS-PAGE電泳圖譜見圖7。

由圖5可見，酶解pH值對(duì)NR影響較大。當(dāng)pH值為6.0時(shí)，酶解液中的NR值最大，DH也相對(duì)

較高，pH值6.0為最佳的酶解pH值。與Alcalase，Protamex 2種蛋白酶的酶解相比，可能與木瓜蛋白酶 本身的酶解性質(zhì)有關(guān)，其所得的NR、DH均較小，沒有前面2種Alcalase，Protamex 2種蛋白酶的酶解效果那么好。

由圖6可見，反應(yīng)pH值為5.0時(shí)，A、B區(qū)分的含量隨酶解時(shí)間的增長而呈下降趨勢，C區(qū)分的含量則呈現(xiàn)增加的趨勢，酶解1 h，C區(qū)分的含量已經(jīng)接近60%。

反應(yīng)pH值為6.0時(shí)，A、B區(qū)分的含量隨酶解時(shí)間的增長，總體呈下降趨勢。酶解4～6 h，A區(qū)分的含量接近，約8.5%；酶解2～4 h，B區(qū)分的含量接近，約14%；酶解1 h時(shí)，C區(qū)分的含量已經(jīng)接近60%，之后逐漸增大。

反應(yīng)為pH值7.0時(shí)，酶解4 h之時(shí)，其A區(qū)分的含量最小，為10.1%；酶解6h，A區(qū)分的含量反而升高到12.5%；在4～6 h的酶解階段，C區(qū)分含量比較接近，B區(qū)分的含量則下降，可認(rèn)為中分子的B區(qū)分在4～6 h的酶解階段，應(yīng)該有部分多肽重新聚集又轉(zhuǎn)化成為了高分子的A區(qū)分的部分。

由圖7可見，3個(gè)pH值條件下酶解所得的酶解液分子量分布的變化比較小，主要分子量分布在30 000，19 000，15 000，6 000 Da。綜合圖 5～ 圖 7的結(jié)果，選取反應(yīng)pH值為6.0。

2.3 溫度對(duì)大豆蛋白酶解產(chǎn)物的影響

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，酶用量8 000 U/g，pH值6.0，分別在55，60，65℃下對(duì)大豆蛋白酶解，過程滴加濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH值在6.0。取不同時(shí)間段的酶解液，測量其NR、DH，以及酶解液Lundin分布和電泳后的分子量分布。

酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響見圖8，溫度對(duì)酶解液Lundin A、B和C區(qū)分分布的影響見圖9，不同溫度條件下隨反應(yīng)時(shí)間所得酶解液的SDS-PAGE電泳圖譜見圖10。

由圖8可見，隨反應(yīng)時(shí)間的延長，溫度對(duì)NR、DH的變化影響基本一致。酶解1～3 h，NR增大，隨后NR下降。酶解初期（50～70 min之前），DH增長很快，80 min之后增加變緩。酶解溫度為60℃時(shí)，在相同的反應(yīng)時(shí)間時(shí)，其酶解液的NR、DH都為最大，酶解的效果最好。

由圖9可見，反應(yīng)溫度對(duì)木瓜蛋白酶的酶解反應(yīng)及其Lundin分布的影響較大。隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，基本呈現(xiàn)A、B區(qū)分的含量逐漸降低，C區(qū)分不斷升高的趨勢。酶解2 h后，C區(qū)分含量都在60%或60%以上，其中60℃的酶解溫度，C區(qū)分的含量最大，表明60℃下木瓜蛋白酶的酶解效果較突出。

在65℃，1～6 h的階段，其A區(qū)分的含量都比反應(yīng)溫度55，60℃的大，表明在65℃的酶解，酶活力降低，酶解大分子蛋白的能力較差。

比較關(guān)注的B區(qū)分，對(duì)55，65℃的酶解溫度，在2～6 h階段，B區(qū)分保持在15%左右；60℃的酶解溫度，在2～4 h階段，B區(qū)分接近15%。

由圖10可見，當(dāng)溫度增至65℃，反應(yīng)1 h時(shí)出現(xiàn)了分子量大于43 000 Da的大分子多肽，表明此時(shí)酶的活力較弱，酶解大分子蛋白的能力較差，與圖9的Lundin分布圖上A區(qū)的變化情況一致（65℃時(shí)，其A區(qū)分的含量最大）。由此可見，要得到A區(qū)分分布較高的酶解液，可以通過提高反應(yīng)溫度來實(shí)現(xiàn)，但是較高的反應(yīng)溫度會(huì)使得酶活力降低，使得NR、DH降低，綜合B區(qū)分等因素，選擇反應(yīng)溫度為 55～60 ℃。

2.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大豆蛋白酶解產(chǎn)物的影響

酶用量8 000 U/g，酶解溫度60℃，pH值6.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在4%，5%，6%，7%進(jìn)行反應(yīng)，過程滴加濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH值6.0。取不同時(shí)間段的酶解液，測量其NR、DH，以及酶解液Lundin分布和電泳后的分子量分布。

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響見圖11，不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)下隨反應(yīng)時(shí)間所得的酶解液的SDS-PAGE電泳圖譜見圖12。

由圖11可見，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，DH輕微地降低，較高底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)使得酶解液黏度增大，影響木瓜蛋白酶擴(kuò)散，降低水分活度，對(duì)酶解反應(yīng)有抑制作用。隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，NR先升高，到底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%之時(shí)，NR最大；7%時(shí)，NR又變小。酶解3 h之前，NR都隨酶解的進(jìn)行而不斷升高，隨后的3～6 h階段，NR都逐漸輕微地降低。

由圖12可見，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解產(chǎn)物的分子量變化有一定的影響。7%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在水解初期，可見還存在分子量接近于43 000 Da的大分子多肽；酶解至2.5 h，就只存在分子量小于或等于20 100 Da的多肽組分了。4%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在酶解初期，還可見存在分子量接近于31 000 Da和大于20 100 Da的諸多的多肽譜帶；酶解至2.5 h，就只存在分子量（遠(yuǎn)）小于20 100 Da的多肽組分了。

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶用量、pH值、溫度等試驗(yàn)的幾個(gè)因素相比，屬于較次要的影響因素?？紤]NR和DH，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～6%比較適宜，為獲得較高的原料利用率，選擇6%。

3 結(jié)論

（1）為了得到可以與糖漿復(fù)配、用于部分或全部替代麥汁的酶解液，所選取的酶解條件并不是得到最佳水解度的酶解條件。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為1～2 h時(shí)，所得到的酶解液的Lundin分布較為接近麥汁Lundin區(qū)分分布的要求，此時(shí)的NR值為52.2%。

（2）木瓜蛋白酶制取含氮糖漿復(fù)配酶解液的最佳條件為酶解溫度55～60℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，酶用量8 000 U/g，pH值6.0，反應(yīng)時(shí)間1～2 h，所得的酶解液為淺黃色，外觀較好，與啤酒糖漿相容、易混，口味風(fēng)味和諧，因此采用木瓜蛋白酶制取啤酒糖漿復(fù)配的蛋白氮源的酶解液是可行的。

（3） 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，就單獨(dú)使用Alcalase、Protamex和木瓜蛋白酶中的任何一種酶，發(fā)現(xiàn)在一定的酶用量、pH值、溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解時(shí)間下，所得到的大豆蛋白酶解液的Lundin分布，要與麥汁Lundin區(qū)分分布的A區(qū)分含量25%、B區(qū)分含量15%和C區(qū)分含量60%的要求相同，是很難或者不可能實(shí)現(xiàn)的，實(shí)際運(yùn)用時(shí)也沒有必要，接近或者相近即可。因此，采用單（蛋白） 酶在各自不同的條件下進(jìn)行酶解，測定的酶解液的Lundin分布，依此計(jì)算，按一定的質(zhì)量比例將其混合，得到的（混合的） 大豆酶解液，其Lundin分布更容易滿足麥汁Lundin區(qū)分分布的A區(qū)分含量25%、B區(qū)分含量15%和C區(qū)分含量60%的要求，是今后研究工作的方向。比如，木瓜蛋白酶的酶解液雖然蛋白質(zhì)回收率較低，但是其中高分子可溶性蛋白含量要比Alcalase、Protamex 2種酶的酶解所得酶解液中的高分子蛋白的含量多。因此，采用木瓜蛋白酶制取的蛋白酶解液，主要側(cè)重于提高復(fù)配蛋白酶解液中高分子蛋白的含量。

（4） 對(duì)于Alcalase、Protamex和木瓜蛋白酶酶解的大豆蛋白酶解液，以及麥汁中的可溶蛋白質(zhì)，雖然參考文獻(xiàn)[17]的方法，按其溶解特性和分子量的大小，將其分為A、B和C的3種區(qū)分。但是，不同來源和酶解方法得到的樣品或麥汁，可溶蛋白的A區(qū)分或B區(qū)分或C區(qū)分，只是代表這些多肽組分具有相同的化學(xué)溶液溶解特性，以及相同相近的范圍分子量大小，它們各自的蛋白分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)是不同的。各個(gè)相同區(qū)分的多肽，對(duì)啤酒酵母來說，是分子量相同相近而化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的有機(jī)氮源的營養(yǎng)成分。因此，即使它們的Lundin區(qū)分分布都是A區(qū)分含量25%、B區(qū)分含量15%和C區(qū)分含量60%，但各自的使用效果和終端發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)，也一定會(huì)存在輕微的差異不同。①葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和低聚糖等糖類，已經(jīng)比較清楚其在啤酒釀造過程的作用，以及對(duì)啤酒產(chǎn)品品質(zhì)的影響，從而指導(dǎo)了啤酒用淀粉糖漿的開發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用。對(duì)于這些相同區(qū)分的不同化學(xué)結(jié)構(gòu)和來源的大豆多肽，其對(duì)啤酒釀造和產(chǎn)品品質(zhì)的影響機(jī)理及其結(jié)果，是一個(gè)值得深入研究的課題。②在①理論研究的基礎(chǔ)上，對(duì)使用大豆或其他新的有機(jī)氮源進(jìn)行替代或部分替代，用于啤酒或其他傳統(tǒng)食品的發(fā)酵，這種差異不同也將孕育產(chǎn)生新的風(fēng)味、口感和差異化產(chǎn)品的可能，也指導(dǎo)著課題下一階段的工作研究重點(diǎn)。