張 軍，李靖靖

(鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，河南 鄭州 450044)

梨是人們最喜愛的水果之一，其獨(dú)特的香氣是構(gòu)成梨品質(zhì)的重要因素。作為世界四大水果之一，全世界有 88 個(gè)國家和地區(qū)生產(chǎn)梨[1]。栽培品種分為東方梨或亞洲梨和西洋梨兩大類[2]。據(jù)美國農(nóng)業(yè)部海外農(nóng)業(yè)服務(wù)局提供的數(shù)據(jù)顯示，2017年全球鮮食梨產(chǎn)量達(dá)到2530萬t，中國梨產(chǎn)量達(dá)到1930萬t[3]。隨著產(chǎn)品的大量供給和人們需求價(jià)值的提高，對(duì)品質(zhì)追求從外觀、口感等轉(zhuǎn)向內(nèi)在的、隱性的品質(zhì)，消費(fèi)者愈發(fā)重視果實(shí)的香氣品質(zhì)。因此，果實(shí)香氣品質(zhì)成為近年來水果產(chǎn)業(yè)的重要的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。

1 梨果實(shí)香氣的研究思路和態(tài)勢(shì)分析

果實(shí)的香氣是評(píng)價(jià)果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。近年來，對(duì)水果(蔬菜)香氣品質(zhì)的研究受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。水果(蔬菜)的揮發(fā)性氣味被人們稱作芳香性氣味，也稱之為果實(shí)的香氣。評(píng)價(jià)果實(shí)品質(zhì)的主要指標(biāo)通常有個(gè)頭大小、表面完好程度、顏色、耐貯性等，而對(duì)果實(shí)香氣品質(zhì)評(píng)價(jià)卻一直沒有確定的、明晰的評(píng)定方法。

早在1927年，Harley和Fisher 通過熱崩解有機(jī)化學(xué)物質(zhì)的方法(逆向假定)研究發(fā)現(xiàn)Bartlett梨揮發(fā)性氣體中含有乙醛，拉開了人們研究梨果實(shí)香氣成分的序幕。隨后的1938年，Tindale 等發(fā)現(xiàn)Bartlett梨揮發(fā)性氣體中除了含有乙醛外還有乙醇，并隨著貯藏時(shí)間而變化。1952 年，英國科學(xué)家Martin 和 James 發(fā)表用氣相色譜分離低碳數(shù)脂肪酸、揮發(fā)性胺等的方法，這標(biāo)志著氣相色譜法正式進(jìn)入歷史舞臺(tái)。1955年第一臺(tái)商品氣相色譜儀的推出[4]是科學(xué)家研究痕量氣體的里程碑事件，從此人們對(duì)果實(shí)揮發(fā)性氣體(香氣)的研究進(jìn)入了一個(gè)嶄新時(shí)代——從模糊假定推測到精確定性定量。1956年，Mehlitz 和 Matzik 使用氣相色譜法研究了不包括Bartlett梨在內(nèi)的其他幾種梨果實(shí)中揮發(fā)性酸和酯的含量，Jennings W在1961年使用同樣的方法再次研究了Bartlett梨，定性定量了大量的酯等成分。由于氣相色譜的使用，在1962年Drawert研究了梨果實(shí)中甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇、異丁醇、正丁醇、正戊醇、2-甲基丙醇、甲基丁醇、正己醇酯等等。1970年， Nursten 證明了癸二烯酸酯是Bartlett梨的特征香氣成分或定義為“賦予食品獨(dú)特香氣的化合物”。自此，對(duì)于果實(shí)香氣的研究由定性定量進(jìn)入了特征成分確定階段。自1990年P(guān)aillard 發(fā)表了關(guān)于蘋果、梨、榅桲的風(fēng)味的文章后，對(duì)于西洋梨和東方梨的香氣研究越來越多。雖然已有50多個(gè)栽培品種梨屬植物，已鑒定出300多種化合物，包括烴類、醛類、醇類、酯類、酮類和含硫化合物等，但是相對(duì)于蘋果、桃、草莓、香蕉，梨果實(shí)香氣的研究仍然較少。

隨著基因組學(xué)和代謝組學(xué)等理論的發(fā)展以及GC-MSMS等超痕量檢測技術(shù)的應(yīng)用，結(jié)合QTLs 分析技術(shù)、基因芯片和 RNA seq 等信息處理高新技術(shù)的廣泛應(yīng)用，香氣物質(zhì)代謝過程中的關(guān)鍵酶及調(diào)控因子不斷得到明確，克隆和分離果實(shí)香氣的相關(guān)基因不斷取得相應(yīng)成果。常見諸報(bào)端的研究有蘋果、草莓、番茄等，而鮮有對(duì)梨果實(shí)香氣的代謝研究。1975年Strandjev研究了東方梨，1990年Haruyasu研究了西洋梨在成熟及其貯藏過程中香氣的動(dòng)態(tài)變化，開始了梨果實(shí)香氣的動(dòng)態(tài)研究。1998年美國芝加哥大學(xué)Natilia Dudareva成功克隆了仙女扇花香氣的BEAT基因；1999年Christian Chervin研究了梨成熟過程中乙醇脫氫酶基因表達(dá)和乙醇產(chǎn)生的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)乙醇脫氫酶(ADH酶)是果實(shí)香氣合成過程中重要的酶。從此，對(duì)果實(shí)香氣的探索進(jìn)入到生化及分子層面。

我國對(duì)果實(shí)香氣的研究相對(duì)較晚，1991年張富春[5]研究了獼猴桃的香氣成分是果實(shí)香氣研究的起點(diǎn)；1992年梁蓮莉[6]開始對(duì)薔薇科刺梨果實(shí)香氣進(jìn)行研究。從此，有多人對(duì)各種梨的香氣進(jìn)行了定性定量分析。2014年，廖鳳玲[7]開始研究梨香氣的生理機(jī)制，巴金磊[8]研究了梨果實(shí)香氣的α-法尼烯基因，Li G等[9]研究酯類與香氣相關(guān)基因；2016年，Wei S等[10]通過轉(zhuǎn)錄組揭示了與香氣代謝和釋放相關(guān)基因；2017年，王龍[11]研究了梨果實(shí)在冷藏條件下酯類香氣物質(zhì)代謝途徑關(guān)鍵酶活性及蛋白表達(dá)水平的變化。1992—2017年，國內(nèi)科學(xué)家用25年的時(shí)間完成了歐美等國對(duì)梨果實(shí)香氣90年(1927—2017年)的研究歷程。

使用Web of Science選擇所有數(shù)據(jù)庫，檢索關(guān)鍵詞“pear & aroma”，得到174篇國內(nèi)外對(duì)梨果實(shí)香氣的研究結(jié)果，其中研究論文占170篇。使用中文知網(wǎng)檢索關(guān)鍵詞“梨and香氣”，共有學(xué)術(shù)論文390篇，主要集中在2010年以后。綜上，國內(nèi)外科學(xué)家對(duì)于果實(shí)香氣的研究按照香氣成分定性定量、果實(shí)特征香氣的確定、香氣成分的前體物質(zhì)、代謝機(jī)制及分子機(jī)理這一路線實(shí)現(xiàn)。

2 梨果實(shí)香氣的成分及其研究方法

目前，已經(jīng)鑒定出不同品種梨果實(shí)中300多種香氣化合物，按香氣化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以分為酯類、醛類、醇類、酮類、酸類等五類揮發(fā)性物質(zhì)。不同的果實(shí)品種中這些揮發(fā)性化合物的種類和比例各不相同，構(gòu)成了果實(shí)特有的香氣特征。有研究認(rèn)為，酯類是西洋梨特征水果味或聞起來香甜的香氣揮發(fā)性成分[12]，構(gòu)成西洋梨果實(shí)特征香氣成分是己醛、己酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸己酯、乙酸己酯、丙酸乙酯等[13]，其中辛酸乙酯給予梨果實(shí)有甜蜜的嗅感。李國鵬[14]等認(rèn)為東方梨香氣成分主要有丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、己醛、己烯醛、α-法尼稀等。

對(duì)于含量微小的果實(shí)香氣的鑒定是隨著高精密儀器的發(fā)展而被確認(rèn)的。隨著GC-MS等精密儀器的出現(xiàn)，香氣成分的研究也更加深入廣泛，而對(duì)于香氣成分的采集(萃取)或香氣分析的前處理方法成為決定該項(xiàng)研究的關(guān)鍵步驟。通常，對(duì)于氣態(tài)揮發(fā)性化合物的富集一般有以下幾種方法：

(1)同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)。利用揮發(fā)性氣體樣品(蒸汽)和萃取劑蒸汽在密閉的裝置中充分混合，組分在低于各自沸點(diǎn)時(shí)被蒸餾出來，樣品揮發(fā)性成分首先被蒸餾出來，然后和萃取劑在冷凝管中完成萃取分離。SDE法的優(yōu)點(diǎn)是將樣品和溶劑萃取兩步過程合二為一，與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾方法相比，減少了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約了大量溶劑，同時(shí)也降低了樣品在轉(zhuǎn)移過程中的損失。在揮發(fā)性氣體研究方面一直被人們使用，如張鳳芳等[15]使用SDE提取蔥的揮發(fā)性成分，Hong J H等[16]對(duì)柑橘香氣進(jìn)行研究。對(duì)梨果實(shí)香氣的應(yīng)用也多有報(bào)道，如使用SDE前處理結(jié)合GC-MS研究東方梨的香氣、結(jié)合GC-MS研究La France pear成熟時(shí)的香氣成分，等等。

(2)超臨界萃取法(SFE)。以二氧化碳等氣體為萃取載體，因其安全、性質(zhì)穩(wěn)定，常用于食品的分析[17]。果實(shí)的揮發(fā)性香氣多部分是非極性的小分子化合物，二氧化碳是其優(yōu)良的溶劑，對(duì)果實(shí)香氣的研究也常見于報(bào)道，如Stefano等[18]對(duì)草莓的香氣進(jìn)行分析，Lacassie等[19]使用SFE萃取技術(shù)用GC-MS分析了梨等果實(shí)的香氣，婁在祥等[20]研究了庫爾勒香梨的香氣精油成分。

(3)固相微萃取法(SPME)。該法是應(yīng)現(xiàn)代儀器的要求而產(chǎn)生的樣品前處理新技術(shù)，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，真正實(shí)現(xiàn)樣品的現(xiàn)場采集和萃取。設(shè)備小巧，攜帶方便，能夠與各種色譜及色質(zhì)等精密分析儀器聯(lián)用。1989年加拿大Waterloo大學(xué)的科學(xué)家Pawliszyn提出了該新型樣品前處理技術(shù)原理，1993年美國Supelco公司取得專利并商品化，且于1994年獲美國匹茲堡分析儀器會(huì)議革新大獎(jiǎng)，該技術(shù)在近十幾年內(nèi)受到了廣泛的關(guān)注。該方法的基本原理是將各種樣品中揮發(fā)性化合物直接吸附到一根帶有吸附劑涂層的熔融石英纖維上，依照“相似相溶”原理對(duì)有機(jī)物進(jìn)行吸附，從樣品中將組分萃取出來，逐漸富集，然后解吸分析物至相連接的分析檢測設(shè)備。固相微萃取的核心是萃取裝置石英纖維上的吸附劑涂層，目前有兩類：一類是均相聚合物涂層，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚丙烯酸酯(PA)，其中PDMS是一種高黏度橡膠狀液體，PA涂層呈固態(tài)水晶狀，在解析溫度下可轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)，二者均屬高黏性液相涂層，作用是吸收萃取待測物；另一類是多相多孔聚合物涂層，如聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯/碳分子篩(PDMS/DVB/CAR)等，這一類為固相涂層，作用是以吸附機(jī)理進(jìn)行萃取[21]。該技術(shù)設(shè)備裝置結(jié)構(gòu)簡單，小巧緊湊，形狀像一只醫(yī)用注射器，由手柄和萃取頭兩部分構(gòu)成。萃取頭頂端涂有不同類型吸附劑的熔融石英纖維頭，用于萃取、吸附樣品，手柄用于安裝或固定萃取頭，可永久使用。隨著萃取吸附劑材質(zhì)的改進(jìn)，新型涂層不斷被發(fā)明和應(yīng)用， SPME 技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于環(huán)境、食品、醫(yī)藥化工等多個(gè)領(lǐng)域。對(duì)于果實(shí)香氣(揮發(fā)性氣體)的研究比較多，Giannetti等[22]對(duì)蘋果香氣進(jìn)行研究，Cuevas等[23]研究鮮橙的香氣成分，張涵等[24]研究對(duì)比了我國常見的4 種主栽柑橘類香氣，周立華等[25]研究了7 種小漿果香氣成分等等。對(duì)于梨香氣的研究主要出現(xiàn)在1995以后，如Suwanagul研究了4種西洋梨的香氣成分，Zlati等[26]研究了Bartlett在不同階段的香氣問題，Chen等[27]研究了鴨梨的香氣，Li G[28]研究了11種東方梨的香氣，Wei S等[29]使用SPME研究了南果梨的香氣變化。

3 梨果實(shí)香氣代謝的生化機(jī)制

果實(shí)香氣來源于果實(shí)的次級(jí)代謝，次級(jí)代謝依賴主代謝正常進(jìn)行。參與主代謝的化學(xué)物質(zhì)，也即香氣成分的前體物質(zhì)，由于參與生物代謝反應(yīng)不同，產(chǎn)生香氣(揮發(fā)性)小分子化合物的途徑也不一樣。按照前體物質(zhì)的類型，可將香氣代謝合成的途徑分為脂肪酸代謝途徑、氨基酸代謝途徑和糖類代謝途徑(單糖)等，其中起決定作用的酶類主要有脂氧合酶(LOX)、醇脫氫酶(ADH)、醇?；D(zhuǎn)移酶(AAT)、β-葡萄糖苷酶(CB)。隨著果實(shí)所處的發(fā)育階段的不同，相關(guān)酶類活性也不同，從而產(chǎn)生不同的果實(shí)香氣物質(zhì)。在不同的階段酶的活性受相關(guān)酶基因的調(diào)控，如LOX基因家族對(duì)果實(shí)香氣成分中的酯類的調(diào)節(jié)，等等。

3.1 脂肪酸代謝途徑

果實(shí)香氣的主要成分是酯類、醇和醛類，這些物質(zhì)的前體物質(zhì)大多來自脂肪酸的轉(zhuǎn)化，這一類香氣產(chǎn)生的路徑叫作脂肪酸路徑。在果實(shí)香氣合成過程中的脂肪酸路徑有三種類型：α-氧化、β-氧化和脂氧合酶(LOX)途徑，以β-氧化和LOX 途徑為主。LOX 途徑在很多果實(shí)的香氣物質(zhì)代謝中都得到了驗(yàn)證，如蘋果、甜瓜、桃、梨等[30-33]。LOX 途徑至少有脂氧合酶(LOX)、氫過氧化物裂解酶(HPL)和乙醇脫氫酶(ADH)參與反應(yīng)，其中脂氧合酶是 LOX 途徑中的第一步反應(yīng)關(guān)鍵酶，決定反應(yīng)的進(jìn)行。在反應(yīng)起始它識(shí)別不飽和脂肪酸的“二烯”結(jié)構(gòu)并使其氧化形成過氧羥基脂肪酸，根據(jù)其加氧位點(diǎn)不同把LOX酶分成9-LOX和13-LOX兩種類型。LOX基因已從許多植物中分離和鑒定，在果實(shí)發(fā)育成熟過程中，LOX基因家族差異調(diào)節(jié)香氣的代謝，如蘋果、梨果實(shí)香氣的作用等。脂肪酸代謝途徑如圖1。

圖1 脂肪酸產(chǎn)生香氣的路徑

3.2 氨基酸代謝途徑

果實(shí)組織中含有的氨基酸在酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閾]發(fā)性的有支鏈脂肪族醇、醛、酮和短鏈酯類物質(zhì)[34]，果實(shí)香氣的這一來源被稱為氨基酸代謝路徑。氨基酸路徑有兩個(gè)支路：一條途徑是在脫羧酶作用下生成醛，然后在醇脫氫酶(ADH)的作用下生成醇，接著參與或者不參與酯的合成；另一條途徑是氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成α-酮酸，α-酮酸與輔酶A(CoAs)生成?；鵆oAs，然后在醇?；D(zhuǎn)移酶(AAT)作用下生成酯[35]。參與香氣合成的氨基酸主要有纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和苯丙氨酸等，其中纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和丙氨酸為甲基支鏈酯合成的前體物質(zhì)。在一些果實(shí)中已經(jīng)得到證實(shí)，如草莓、甜瓜、梨，等等[36-38]。氨基酸產(chǎn)生香氣的路徑如圖2。

圖2 氨基酸產(chǎn)生香氣的路徑

3.3 糖類代謝途徑

果實(shí)中含有豐富的糖，其中單糖、雙糖和一些糖醇不但是果實(shí)風(fēng)味的來源，同時(shí)也是果實(shí)香氣的重要前體物質(zhì)。糖的本質(zhì)是多羥醛或多羥酮，這些小分子糖經(jīng)EMP途徑(Embden Meyerhof Parnas pathway)無氧條件下經(jīng)糖激酶分解成丙酮酸，再在丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(pyruvate dehydrogenasecomplex)的催化下進(jìn)行氧化脫羧反應(yīng)生成乙酰輔酶A。乙酰輔酶A有兩條途徑合成酯：一是在醇轉(zhuǎn)酯酰酶(AAT)催化下生成乙酸某酯；另一個(gè)是在還原酶催化下先生成乙醇，再合成某酸乙酯，具體如圖3所示。

圖3 碳水化合物產(chǎn)生香氣的路徑(單糖)

4 展望

果實(shí)香氣是反應(yīng)果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)。在物質(zhì)生活日益豐富的今天，人們對(duì)品質(zhì)的追求趨向完美，對(duì)消費(fèi)水果(食品)追求趨向決定了水果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。因而，果實(shí)香氣成了近年來研究的熱點(diǎn)。從目前已發(fā)表的研究成果來看，果實(shí)香氣相關(guān)研究主要集中在香氣的種類和品種間果實(shí)香氣的差異，果實(shí)特征性香氣的確定，主要類別的香氣物質(zhì)代謝途徑，果實(shí)成熟及其貨架期、貯藏期果實(shí)香氣成分及相關(guān)酶活性的變化等方面，而在如何通過傳統(tǒng)的田間管理等人為手段精準(zhǔn)地干預(yù)果實(shí)主代謝，進(jìn)而影響次代謝的香氣合成和釋放，以及利用遺傳工程、基因操作技術(shù)來改善果實(shí)的香氣成分，調(diào)控果實(shí)香氣的代謝，從而達(dá)到提高果實(shí)品質(zhì)等方面研究較少。隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展和分子育種等理論的不斷完善，利用分子生物學(xué)技術(shù)手段，了解果實(shí)香氣代謝基因的信息，研究闡明果實(shí)香氣代謝的關(guān)鍵酶基因的功能，達(dá)到對(duì)果實(shí)香氣代謝的精準(zhǔn)調(diào)控，是研究果實(shí)香氣的必然趨勢(shì)。

隨著梨果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，梨品質(zhì)提升日益凸顯，特別是在果實(shí)香氣方面尤顯突出。本文分析總結(jié)國內(nèi)外梨果實(shí)香氣研究的特點(diǎn)，以期給我國梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展中出現(xiàn)的香氣問題提供一定的線索和啟示。