張麗，方步武

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，天津300070）

肝纖維化是慢性肝損傷引起的一種病理性傷口愈合反應(yīng)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的過(guò)度沉積[1]。在肝纖維化發(fā)展過(guò)程中肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells, HSCs）是ECM的主要來(lái)源細(xì)胞[2]。核因子NF-E2 相關(guān)因子2（NFE2-related factor 2,Nrf2）是重要的轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2 可促進(jìn)抗氧化基因如血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而保護(hù)組織和細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激[3-4]。本研究采用的虎杖苷由于具有抗氧化及保肝作用，可用于一些肝臟疾病的治療[5-6]。但關(guān)于虎杖苷對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的影響及作用機(jī)制尚未深入研究。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)HSC-T6 細(xì)胞，用不同濃度虎杖苷處理，探討虎杖苷對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞是大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6，由北京地壇醫(yī)院提供。

1.1.2 主要試劑 虎杖苷（Polydatin）購(gòu)于大連美侖生物公司，Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司，羥脯氨酸測(cè)定試劑盒和LDH 活力測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，β-actin 抗體、α-tubulin 抗體和BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，CollagenⅠ抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)公司，α-SMA 抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology（CST），HO-1 抗體購(gòu)于Abconal，Nrf2 抗體購(gòu)于Pepro Tech 公司。

1.1.3 主要儀器 680 酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD 公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)NAPCO series5400），DL-CJ-2NDI 潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司），WD-9405A 型脫色搖床（北京六一儀器廠），湘儀L420 低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司），垂直電泳槽（美國(guó)BIO-RAD 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS（Gibco，USA），50 U/mL 青霉素/鏈霉素的DMEM（Gibco，USA）中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)分4 組：（1）對(duì)照組。（2）不同濃度虎杖苷（Polydatin）給藥組：125、250、500 μmol/L。給藥時(shí)間為48 h。

1.2.2 細(xì)胞活力測(cè)定 使用MTT 法測(cè)定虎杖苷對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖的影響。將HSC-T6 細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組以5×104個(gè)/mL 的密度接種于96 孔板中。培養(yǎng)24 h 后用不含血清的DMEM 饑餓12 h，然后用不同濃度的虎杖苷處理細(xì)胞。處理48h 后每孔加入20μL 0.5%MTT，繼續(xù)孵育4 h，吸出廢液，每孔加入200 μL DMSO 溶解產(chǎn)生的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臢（formazan），震蕩10 min，490 nm 處測(cè)定每孔的吸光度值。細(xì)胞活力計(jì)算公式：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值）×100%。

1.2.3 LDH 活力測(cè)定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。比色法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性，取20 μL 細(xì)胞上清液，按照LDH 活力測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，波長(zhǎng)450 nm 酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。LDH 活性（U/L）=[（測(cè)定OD 值－對(duì)照OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD 值－空白OD 值）]×1 000×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.2 μmol/mL）。

1.2.4 羥脯氨酸（Hyp）含量測(cè)定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。酶消化法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中Hyp 的含量，取500 μL 細(xì)胞上清液，根據(jù)Hyp 測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，波長(zhǎng)550 nm 處，1 cm 光徑，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度。羥脯氨酸含量（μg/mL）=[（測(cè)定OD 值－空白OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD 值－空白OD 值）]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（5 μg/mL）。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)Ⅰ型膠原（collagenⅠ）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Nrf2 和HO-1 蛋白的表達(dá) 按照實(shí)驗(yàn)分組，將HSC-T6 細(xì)胞以5×104個(gè)/mL 密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后用不含血清的DMEM 饑餓12 h，然后用不同濃度虎杖苷處理細(xì)胞48 h。藥物處理后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入適量含有1%PMSF 的RIPA 裂解液來(lái)提取蛋白并用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后，取等量蛋白SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，使用5%脫脂牛奶阻斷非特異性蛋白結(jié)合，4℃下孵育一抗（collagenⅠ1:500、α-SMA 1:1 000、Nrf2 1:1 000、HO-1 1:1 000）過(guò)夜。次日，TBST 洗膜3 次，每次7 min，HRP 結(jié)合二抗（1:1 000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次后，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，采用Image J 軟件對(duì)蛋白條帶的光密度值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，所有符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(±s 表示。多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊則采用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊采用Dunnett T3檢驗(yàn)。以P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 虎杖苷對(duì)細(xì)胞增殖的影響 如圖1 所示，與對(duì)照組比較，不同濃度的虎杖苷（125、250、500 μmol/L）作用于HSC-T6 細(xì)胞48 h后，對(duì)HSC-T6 細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用（F=252.01，P＜0.001）；與虎杖苷125 μmol/L 組比較，虎杖苷250、500 μmol/L組中細(xì)胞活力顯著降低（F=252.01，P＜0.001）；與虎杖苷250 μmol/L 組比較，虎杖苷500 μmol/L 組中細(xì)胞活力顯著降低（F=252.01，P＜0.001）。

2.2 虎杖苷對(duì)LDH 活力的影響 與對(duì)照組（80.34±13.61）U/L 比較，虎杖苷125、250、500 μmol/L 組中LDH 活性無(wú)明顯變化[（84.83±8.71）、（82.91±12.26）、（79.91±10.28）U/L]，如圖2 所示，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.246，P＞0.05）。

2.3 虎杖苷對(duì)Hyp 含量的影響 如圖3 所示，與對(duì)照組[（2.91±0.18）μg/mL]比較，虎杖苷125、250、500μmol/L組中Hyp 含量顯著降低[（2.61±0.13）、（2.29±0.13）、（2.05±0.19）μg/mL；F=16.50，P＜0.05]；與虎杖苷125 μmol/L 組比較，虎杖苷250、500 μmol/L 組Hyp 含量顯著減少（F=16.50，P＜0.05），且隨著濃度的增高，抑制作用越明顯，呈一定的劑量依賴(lài)性。

圖1 虎杖苷對(duì)細(xì)胞增殖的影響（±SD,n=6）Fig 1 Effects of Polydatin on the proliferation of cell(±SD,n=6)

圖2 虎杖苷對(duì)LDH 活力的影響（±SD,n=6）Fig 2 Effects of Polydatin on the activity of LDH(±SD,n=6)

圖3 虎杖苷對(duì)Hyp 含量的影響（±SD,n=9）Fig 3 Effects of Polydatin on the content of Hyp(±SD,n=9)

2.4 虎杖苷對(duì)α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達(dá)的影響 如圖4 所示，與對(duì)照組比較，虎杖苷125、250、500 μmol/L組中α-SMA 和CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平顯著降低（F=19.89，P＜0.05；F=182.91，P＜0.001）；與虎杖苷125 μmol/L 組比較，虎杖苷250、500 μmol/L 組中α-SMA 和CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平顯著降低（F=19.89，P＜0.05；F=182.91，P＜0.001），隨著劑量增大，抑制作用越明顯，表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性。

圖4 虎杖苷對(duì)α-SMA 和CollagenⅠ蛋白表達(dá)的影響（±SD,n=3）Fig 4 Effects of Polydatin on the protein expression of α-SMA and CollagenⅠ(±SD,n=3)

2.5 虎杖苷對(duì)Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)的影響 如圖5 所示，與對(duì)照組比較，虎杖苷125、250、500 μmol/L組中Nrf2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（F=23.70，P＜0.05），虎杖苷250、500 μmol/L 組中HO-1 蛋白表達(dá)水平顯著增加（F=12.40，P＜0.01）；與虎杖苷125 μmol/L 組比較，虎杖苷250、500 μmol/L 組中Nrf2和HO-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（F=23.70，P＜0.05；F=12.40，P＜0.05），隨著劑量增大，上調(diào)作用越明顯，表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性。

3 討論

肝纖維化是慢性肝損傷引起的一種病理性傷口愈合反應(yīng)，隨著病程的發(fā)展將導(dǎo)致肝硬化，最終導(dǎo)致肝衰竭或肝癌[7]。在肝纖維化階段逆轉(zhuǎn)其進(jìn)展是治療慢性肝病，避免肝功能衰竭的有效策略。

圖5 虎杖苷對(duì)Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)的影響（±SD,n=3）Fig 5 Effects of Polydatin on the protein expression of Nrf2 andHO-1（±SD,n=3）

HSCs 的活化是導(dǎo)致肝纖維化的重要因素[8]。活化的HSCs 表達(dá)α-SMA，合成成纖維細(xì)胞因子并促進(jìn)膠原（如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和Ⅳ型膠原）的產(chǎn)生從而加速肝纖維化的進(jìn)程。當(dāng)在體外培養(yǎng)時(shí)，HSCs 會(huì)發(fā)生自發(fā)激活[9]。本研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷處理HSC-T6細(xì)胞能抑制細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞培養(yǎng)液中Hyp 的含量并下調(diào)α-SMA 及CollagenⅠ蛋白的表達(dá)。其中Hyp 是一種幾乎只存在于膠原蛋白中的氨基酸，被作為衡量肝纖維化的指標(biāo)[10]。由此可得，虎杖苷可以抑制HSC-T6 細(xì)胞的活化及膠原的產(chǎn)生，在體外具有抑制肝纖維發(fā)生的作用。

Nrf2/HO-1 可以減輕肝臟炎癥、減緩肝纖維化的發(fā)展[11-12]。誘導(dǎo)HO-1 的表達(dá)可以抑制HSCs 增殖，降低CollagenⅠ的產(chǎn)生，減輕肝臟氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展[13]。本實(shí)驗(yàn)采用的虎杖苷是從虎杖根中提取的有效成分，由于具有抗氧化作用在一些肝臟疾病的防治中具有重要作用[14-17]。本研究使用不同濃度的虎杖苷處理HSC-T6 細(xì)胞，結(jié)果表明，隨著虎杖苷濃度增加，Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)逐漸增加。

本研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷通過(guò)抑制肝星狀細(xì)胞活化及膠原的產(chǎn)生，發(fā)揮抑制肝纖維化發(fā)生的作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Nrf2/HO-1 信號(hào)通路有關(guān)，這為虎杖苷在肝纖維化治療中應(yīng)用提供了新的思路。