方君，楊瀟，朱利航，陳俊，楊之帆

(1.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室，湖北 武漢 430062； 2.武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430081)

0 引言

乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)是一種胞外糖蛋白，具有核酸酶、氨肽酶和羧肽酶活性，是維持神經(jīng)遞質(zhì)正常傳遞的重要成分[1].AChE也可以在動物體內(nèi)除神經(jīng)系統(tǒng)以外的其他部位合成，這些酶分子參與細胞生長、遷移、粘附和凋亡的過程[2-3].此外，抑制AChE活性將導(dǎo)致動物的麻痹甚至死亡[4].在昆蟲體內(nèi)，AChE是使用最廣的氨基甲酸脂類和有機磷殺蟲劑的靶標酶,AChE突變或異常表達可能是產(chǎn)生抗藥性的原因之一，與害蟲的抗藥性治理密不可分[5-8].2006年克隆得到褐飛虱AChE基因，這為進一步深入研究該基因的結(jié)構(gòu)、表達及功能奠定了基礎(chǔ)[9].昆蟲由于其明顯的表型分化以及較小的基因組，逐漸成為研究DNA甲基化功能的重要生物學(xué)材料.在昆蟲進化過程中，處于高甲基化狀態(tài)的基因比低甲基化或未發(fā)生甲基化的基因更為保守，尤其是氨基酸序列，這也被認為是昆蟲基因組進化中的共有特征[10].DNA甲基化為表觀遺傳修飾的一種主要形式，廣泛存在于基因啟動子區(qū)的CpG位點上，對基因的表達調(diào)控具有重要作用[11].對蜜蜂[12-13]、褐飛虱[14]、果蠅和家蠶[15]等昆蟲的研究發(fā)現(xiàn),昆蟲中不僅存在大量DNA甲基化現(xiàn)象,而且參與調(diào)控眾多生物學(xué)過程.以往對導(dǎo)致昆蟲產(chǎn)生多型性(多種生物型)因素的研究主要集中在環(huán)境因素影響上，昆蟲的表型因適應(yīng)環(huán)境變化而改變，即產(chǎn)生昆蟲的多型性[16].但是對于昆蟲產(chǎn)生多型性的分子機制的研究仍鮮有報道.目前表觀遺傳被認為是導(dǎo)致昆蟲產(chǎn)生多型性的重要因素之一，特別是已證實DNA 甲基化參與某些昆蟲多型性的調(diào)控[17].

我們克隆了褐飛虱AChE基因的啟動子，并研究了生物型Ⅰ和生物型Ⅱ褐飛虱中AChE啟動子的甲基化程度差異，且對比檢測了AChE的表達水平，研究結(jié)果為進一步探討AChE在褐飛虱適應(yīng)環(huán)境及其生物型形成機制中的作用提供一定的參考依據(jù)，同時為防治褐飛虱提供新思路.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器試驗所用生物型Ⅰ褐飛虱飼養(yǎng)在感蟲水稻TN1上，生物型Ⅱ飼養(yǎng)在抗蟲水稻Mudgo上，溫度為(25±2) ℃，光照周期16 L:8 D，相對濕度80%.收集4齡若蟲用于提取基因組DNA和分離總RNA.

Genome walking kit、TaqDNA聚合酶、SYBRRPremixExTaqTM、EpiTaqTMHS (for bisulfite-treated DNA)和pMD18-T均為TaKaRa公司產(chǎn)品；甲基化DNA檢測試劑盒DNA Methylation Kit為康為世紀公司產(chǎn)品；EpiTect? Methylight PCR Kit購于QIAGEN公司；PCR引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成；PCR擴增儀(WD-94020D Thermal Cycler)為北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA純化回收試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 取20頭4齡褐飛虱若蟲，采用改良的酚氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于適量的TE buffer中，用NanoDrop 2000測其純度，取OD260/OD280處于1.8～2.0的DNA樣品置于-20 ℃儲存待用.

1.2.2AChE啟動子克隆 根據(jù)褐飛虱AChE的cDNA(N.lugensacetylcholinesterase type 2,accession number:XM_022332470.1)序列設(shè)計3條嵌套引物(SP1：5′-TGTAATAAGCGAGGATGCCGGTGCC-3′；SP2：5′-CTTGGTAAGGCATCTGTTGCGGACG-3′；SP3：5′-TAGCTAGGCGTACGGTTTCACTGTT-3′)按照Genome walking kit說明書依次進行3輪巢式PCR，第1輪PCR反應(yīng)25 μL體系：基因組DNA 2 μL；dNTP 2.5 μL；LA DNA聚合酶buffer 2.5 μL；引物SP1 0.5 μL；引物AD 0.5 μL；LATaqDNA聚合酶0.5 μL；ddH2O 16.5 μL；反應(yīng)程序：94 ℃ 1 min；98 ℃ 1 min；(94 ℃ 30 s,65 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min)5個循環(huán)；94 ℃ 30 s；25 ℃ 3 min；72 ℃ 3 min；(94 ℃ 30 s,65 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,65 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,44 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min)15個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存.第2輪PCR反應(yīng)：取第1輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍作為模板進行第2輪PCR；25 μL反應(yīng)體系：模板2 μL；dNTP 2.5 μL；LA DNA聚合酶buffer 2.5 μL；引物SP2 0.5 μL；引物AD 0.5 μL；LATaqDNA聚合酶 0.5 μL；ddH2O 16.5 μL;反應(yīng)程序：(94 ℃ 30 s,65 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,65 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,44 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min)15個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存.第3輪PCR反應(yīng)取第2輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍作為模板進行第3輪PCR；25 μL反應(yīng)體系：模板 2 μL；dNTP 2.5 μL；LA DNA聚合酶buffer 2.5 μL；引物SP3 0.5 μL；引物AD 0.5 μL；LATaqDNA聚合酶0.5 μL；ddH2O 16.5 μL；反應(yīng)程序：(94 ℃ 30 s,65 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,65 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,44 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min)15個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存；產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，從凝膠中切取明亮清晰的DNA條帶進行回收，與pMD18-T連接獲得重組DNA分子，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，提質(zhì)粒后測序驗證.

1.2.3 MS-PCR檢測啟動子區(qū)域DNA甲基化 取1 μg的褐飛虱基因組DNA用甲基化DNA檢測試劑盒處理，使未甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ谆陌奏げ蛔?

根據(jù)Methprimer網(wǎng)站(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)設(shè)計兩對啟動子區(qū)域甲基化特異性PCR引物(發(fā)生甲基化引物F-M：5′-TTTATCGAGTTAGTTGTGGAAAGTC-3′；R-M：5′-AACGATAATAAATTATACGCAAACG-3′；未發(fā)生甲基化引物F-U：5′-TATTGAGTTAGTTGTGGAAA GTTGG-3′；R-U：5′-ACAATAATAAATTATACACAAACACA-3′)，在PCR管中依次加入：22 μL ddH2O；25 μL 2×Master Mix；2 μL亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA；上下游引物(發(fā)生甲基化引物/未發(fā)生甲基化引物)各0.5 μL.PCR程序如下：95 ℃ 10 min；(94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)循環(huán)40次；72 ℃ 10 min；4 ℃保存.反應(yīng)產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.2.4 BSP分析兩種生物型甲基化水平 根據(jù)Methprimer網(wǎng)站設(shè)計AChE啟動子區(qū)域甲基化BSP-PCR引物(BSP-F：GGAAAAATTATTTTTTTATTTTAT；BSP-R：TTTCACTATTTTAATAAATCTATACAAT CT).

在PCR管中依次加入：13.75 μL ddH2O；3 μL dNTP Mixture；2 μL Mg2+；2 μL 10×EpiTaqPCR buffer(Mg2+free)；0.25 μL EpiTaqHS；2 μL亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA；上下游引物各0.5 μL.PCR程序如下：95 ℃ 10 min；(94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)循環(huán)40次；72 ℃ 10 min；4 ℃保存.反應(yīng)產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測.切取明亮清晰的條帶進行膠回收，連接T載體pClone-007(擎科生物)后送至武漢擎科生物公司測序.

將克隆測序得到的序列與原DNA序列進行比對，用網(wǎng)站(http://quma.cdb.riken.jp/)進行AChE基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化模式分析，并繪制出黑白點圖.在黑白點圖中，每1行代表1個克隆序列，共10個克隆序列，符合重亞硫酸鹽測序的精確度要求.每1列代表1個CpG位點，黑色圈代表試驗中CG 被重亞硫酸鹽改變堿基即原序列中發(fā)生甲基化的位點，白色圈代表經(jīng)重亞硫酸鹽處理后發(fā)生堿基變化即原序列未發(fā)生甲基化的位點，×表示測序時該位點缺失.

1.2.5 RT-PCR檢測兩種生物型AChE基因的表達水平 分別捉取10頭Ⅰ型和Ⅱ型褐飛虱4齡若蟲按照Trizol (Reagent,USA)說明書進行褐飛虱總RNA的提取.NanoDrop 2000測定總RNA的純度及含量，將OD260/OD280處于1.9～2.1及OD260/OD230為2.0的RNA 樣品按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScripe RT reagent kit，TaKaRa)說明書合成cDNA，-80 ℃保存待用.

利用Beacon Designer 8設(shè)計熒光定量PCR引物，用于檢測褐飛虱AChE以及肌動蛋白β-actin(GenBank登錄號：EU179847.1)在兩種生物型褐飛虱中的表達水平.其中AChE的引物為AChE-F:5′-GGAAAGGGACCTCAGTCTGC-3′，AChE-R:5′-CTGTTGCTCTGGGTCCTCTG-3′；β-actin的引物為actin-F:5′-CCCGTCCACAATGAAGATCAAG-3′,actin-R:5′-GTTGGAAGGTGGAGAGGGAAG-3′.反應(yīng)體系為25 μL:RNase Free H2O 8.5 μL、SYBR 12.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL.反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)循環(huán)40次.記錄溶解曲線，并采用相對定量法計算AChE表達量的變化，每個樣本重復(fù)3次.

圖1 TAIL PCR擴增結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱乙酰膽堿酯酶基因啟動子的克隆及序列分析用染色體步移方法擴增褐飛虱AChE的啟動子，電泳檢測結(jié)果如圖1，1～3泳道分別為3次TAIL PCR結(jié)果.

將最終擴增得到的1 919 bp的DNA片段連入pMD18-T載體，用M13和M13(-)通用引物進行雙向測序.測序結(jié)果顯示，所擴增片段的3′序列與AChE cDNA的5′序列部分重疊，因此所克隆的序列為褐飛虱AChE的啟動子序列.該序列已錄入GenBank中，在GenBank中的登錄號為MK611810.

將克隆的序列利用在線網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/和https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?lang=en&pj=640&action=page&page=newplace)進行啟動子元件及其位置分析發(fā)現(xiàn)，AChE啟動子內(nèi)含多個與MYB、WRKY、ARE等抗性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(元件)如表1，表明該啟動子可能與逆境脅迫相關(guān).

2.2 兩種褐飛虱生物型AChE啟動子區(qū)域甲基化差異分析以亞硫酸氫鹽處理后的生物型Ⅰ和生物型Ⅱ基因組DNA為模板進行MS-PCR擴增，結(jié)果如圖2所示.泳道1和2分別為生物型Ⅰ和生物型Ⅱ的AChE啟動子區(qū)未發(fā)生甲基化位點擴增條帶；3和4分別為生物型Ⅰ和生物型Ⅱ的AChE啟動子區(qū)發(fā)生甲基化-位點擴增條帶.

表1 部分應(yīng)激相關(guān)啟動子元件

圖2 MS-PCR擴增結(jié)果

從圖中1和2看出生物型Ⅱ能擴增出明顯的非甲基化條帶而生物型Ⅰ中擴增出非甲基化條帶較淺，從3和4看出生物型Ⅰ能擴增出明顯的甲基化條帶而生物型Ⅱ中擴增出甲基化條帶不明顯，說明在生物型Ⅰ和生物型Ⅱ的AChE啟動子中甲基化程度存在差異，且生物型Ⅰ的甲基化程度明顯高于生物型Ⅱ.兩種生物型兩對引物均擴增出條帶，表明該CpG位點只部分發(fā)生甲基化.擴增得到的啟動子序列通過網(wǎng)站(http://www.takara-bio.co.jp/enzyme/enzyme_search.php) 進行啟動子區(qū)域受甲基化影響的限制酶酶切位點分析，結(jié)果顯示褐飛虱AChE啟動子區(qū)域主要甲基化酶切位點為CpG methylase(5 mCG),表明褐飛虱AChE啟動子區(qū)域DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶的C-5位.

2.3 BSP分析兩種生物型AChE啟動子甲基化模式分析以亞硫酸氫鹽處理后的生物型Ⅰ和生物型Ⅱ基因組DNA為模板進行BS-PCR擴增，1～4均為Ⅰ型褐飛虱BSP擴增產(chǎn)物；5～8均為Ⅱ型褐飛虱BSP擴增產(chǎn)物.結(jié)果如圖3所示：

圖3 褐飛虱BSP電泳結(jié)果

目的片段經(jīng)膠回收純化，連接pClone007-T載體，菌落PCR驗證后每種生物型均挑取10個陽性克隆子送至武漢擎科生物公司測序.根據(jù)測序結(jié)果利用在線網(wǎng)站(http://quma.cdb.riken.jp/)分析獲得兩種生物型AChE啟動子區(qū)CpG島的甲基化情況，并繪制黑白點圖(圖4和圖5).

圖4 Ⅰ型褐飛虱AChE啟動子區(qū)CpG島甲基化模式

圖5 Ⅱ型褐飛虱AChE啟動子區(qū)CpG島甲基化模式

圖6 熒光定量PCR檢測褐飛虱生物型Ⅰ和生物型Ⅱ中AChE表達水平

由黑白點圖可知：Ⅰ型褐飛虱總體平均甲基化頻率為24.09%，其中10個克隆子中有2個克隆子發(fā)生高甲基化,頻率分別為77.27%和68.18%；第2個CpG位點發(fā)生甲基化的頻率最高為60%.Ⅱ型褐飛虱總體平均甲基化頻率為7.27%，其中10個克隆子中甲基化頻率最高僅為18.18%，有兩個克隆子未發(fā)生甲基化，第11個CpG位點發(fā)生甲基化的頻率最高為40%.

2.4 兩種生物型AChE基因的表達量分析通過熒光定量PCR檢測兩種生物型中AChE的表達水平，參照2-△△Ct[18]方法進行基因表達水平的相對定量分析并繪制圖6.結(jié)果表明AChE在兩種生物型間表達存在差異，且在生物型Ⅱ中的表達量高于生物型Ⅰ，為其1.11倍.兩種生物型間AChE的表達量差異不明顯，推測有可能是兩生物型間mRNA的穩(wěn)定性存在差異.

3 討論

褐飛虱是一種單食性水稻害蟲，主要通過刺吸式口器取食水稻韌皮部汁液.這不僅干擾了水稻同化物質(zhì)的運輸，而且其排泄物易傳播或誘導(dǎo)水稻病害，嚴重影響了水稻的正常生長發(fā)育，造成糧食大量減產(chǎn)[19].目前防治褐飛虱主要是通過噴灑農(nóng)藥.乙酰膽堿酯酶是使用最廣的氨基甲酸酯類和有機磷殺蟲劑的靶標酶，但農(nóng)藥的長時間大范圍施用，不僅污染了環(huán)境，而且會導(dǎo)致褐飛虱產(chǎn)生抗藥性，使其防治更加困難[20].褐飛虱存在多型性現(xiàn)象，根據(jù)對不同抗性水稻品種表現(xiàn)不同的危害性，以及對寄主取食和產(chǎn)卵表現(xiàn)不同的嗜好性分為6種生物型,其中生物型Ⅰ經(jīng)過抗性水稻Mudgo的篩選能演變?yōu)樯镄廷騕21].近期研究發(fā)現(xiàn)AChE具有促進褐飛虱中腸細胞凋亡的功能，且受抗性水稻的誘導(dǎo)[1].但是AChE在褐飛虱與水稻互作中的具體機理尚不清晰.

越來越多的研究表明，昆蟲中DNA甲基化通過改變基因的表達方式可以直接影響胚胎發(fā)育、基因組印跡、級型分化、翅型分化、性別分化和抗藥性等生長發(fā)育進程的調(diào)控[22].在哺乳動物中，DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸的背景下,剩余未發(fā)生甲基化的CpG位點則主要密集分布于基因的啟動子區(qū)域和第一外顯子區(qū)域，被稱為CpG島(CpG island).多基因轉(zhuǎn)錄起始位點分析結(jié)果表明，CpG島是參與基因表達調(diào)控的核心元件.Methprimer網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，AChE啟動子序列中存在一個282 bp的CpG島.因此我們從表觀遺傳的角度分析褐飛虱Ⅰ、Ⅱ生物型間AChE的CpG位點甲基化程度的差異.甲基化限制性酶切位點分析結(jié)果顯示，褐飛虱AChE啟動子區(qū)域主要甲基化酶切位點為CpG methylase(5 mCG)，5-甲基胞嘧啶 (5mC) 甲基位于DNA雙螺旋大溝內(nèi),是眾多蛋白質(zhì)因子與DNA結(jié)合的部位,且含豐富的能被轉(zhuǎn)錄因子識別的GC序列,但CpG發(fā)生甲基化后,轉(zhuǎn)錄因子就不能結(jié)合到DNA上,從而影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū) DNA 的結(jié)合效率，影響轉(zhuǎn)錄水平[23].熒光定量結(jié)果表明甲基化程度高的生物型Ⅰ褐飛虱的表達量低于生物型Ⅱ.

本研究通過染色體步移技術(shù)克隆了褐飛虱AChE的啟動子，該片段長度為1 919 bp.利用在線網(wǎng)站進行啟動子元件及其位置分析發(fā)現(xiàn)，AChE啟動子內(nèi)含多個與MYB、WRKY、ARE等抗性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(元件)，表明該啟動子可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān).采用MS-PCR和實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，生物型ⅠAChE啟動子區(qū)域的甲基化程度高于生物型Ⅱ，這一結(jié)果也與生物型Ⅰ的高遺傳易變性相吻合；同時生物型Ⅱ中的AChE的表達量為生物型Ⅰ的1.11倍.DNA甲基化影響褐飛虱AChE的表達.AChE表達量的增加會使昆蟲維持一定的ACh水解速率，從而緩解殺蟲劑的抑制作用，增強昆蟲對農(nóng)藥的耐受性[24].推測AChE轉(zhuǎn)錄的增加或者mRNA穩(wěn)定性的增加可能是使Ⅱ型褐飛虱較Ⅰ型褐飛虱對農(nóng)藥敏感性降低的原因.啟動子區(qū)CpG島的甲基化水平不同,可能是導(dǎo)致兩種褐飛虱對于宿主抗性具有不同耐受程度的原因.AChE啟動子的甲基化檢測對于褐飛虱生物型識別提供新的手段.本研究中所擴增的AChE啟動子序列為進一步探討AChE在褐飛虱與水稻互作中的作用及研發(fā)新的生物殺蟲劑奠定了基礎(chǔ).