劉亞丹　左周　秦軍軍　楊陽　蔡春波　趙燕　郭曉紅　曹果清　李步高　高鵬飛

摘? 要：旨在利用高通量測序技術(shù)分析晉汾白豬和馬身豬生長早期糞便微生物的多樣性特征及其可能的成因。本研究以馬身豬和晉汾白豬為研究對象，采用16S rRNA高通量測序技術(shù)，對仔豬初生（1日齡）、斷奶（28日齡）和保育后期（70日齡）三個關(guān)鍵的生長發(fā)育階段的糞便微生物多樣性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：本次測序所得的操作分類單元分屬25個門、43個綱、91個目、163個科和470個屬的微生物。多樣性分析表明，生長在相同環(huán)境之下的晉汾白豬和馬身豬在不同的生長階段糞便微生物的組成具有相似之處，初生（1日齡）時容易受到母體及周圍環(huán)境的影響，假單胞菌和志賀菌屬等有害菌屬的細(xì)菌含量較高，乳酸桿菌的數(shù)量隨著仔豬年齡的增長而逐漸增加，在斷奶（28日齡）和保育末期（70日齡）時糞便微生物菌群的多樣性更為相似;在保育末期，兩個豬種的仔豬腸道中普雷沃氏菌和毛螺菌科NK4A136等有助于動物消化代謝的細(xì)菌更為豐富。本研究的結(jié)果可為仔豬腸道微生物定植以及演替的變化規(guī)律提供理論參考。

關(guān)鍵詞：豬;糞便微生物;16S rRNA;菌群多樣性

中圖分類號：S828.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號：1001-0769（2020）06-0022-08

仔豬的飼養(yǎng)管理對生豬生產(chǎn)至關(guān)重要，其健康狀況是影響生豬行業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的首要因素。在生長發(fā)育階段，仔豬容易受一些因素的影響，導(dǎo)致生長速度緩慢和飼料轉(zhuǎn)化率差，并會引發(fā)腹瀉等疾病。腸道微生物組成是決定仔豬是否會出現(xiàn)上述問題的重要因素之一。豬的腸道微生物主要由細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌和病毒等組成，其中細(xì)菌占據(jù)著絕對的優(yōu)勢，且大多數(shù)細(xì)菌為厭氧菌[1]。豬的腸道微生態(tài)物對機(jī)體的生長發(fā)育有重要的作用，對促進(jìn)機(jī)體的物質(zhì)和能量交換、信息傳遞、宿主營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和均衡、免疫以及促生長起著非常重要的作用[2-6]。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的先進(jìn)技術(shù)被用于微生物的研究，其中16S rRNA基因測序技術(shù)被廣泛用于研究動物腸道微生物菌群的多樣性和組成等，為更深層次的研究提供了便利的條件。Chen等采用16S rRNA測序技術(shù)分析了仔豬腸道內(nèi)容物組成的變化，發(fā)現(xiàn)仔豬斷奶后其腸道分泌物中的菌群組成會發(fā)生明顯的改變，腸道微生物的α多樣性隨時間的增長而顯著增加，并在斷奶后10 d左右達(dá)到相對穩(wěn)定的狀態(tài)[7]。Alain等研究了哺乳仔豬糞便中微生物組成的變化，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和擬桿菌門的細(xì)菌是其腸道內(nèi)的主要細(xì)菌;在哺乳期的后期，厚壁菌門細(xì)菌的數(shù)量明顯高于擬桿菌門細(xì)菌的。

馬身豬是山西省的一個優(yōu)良的地方品種，具有繁殖力高、肉質(zhì)好和抗逆性強(qiáng)等特點，但生長速度相對較慢。晉汾白豬是以馬身豬（6.25%）、太湖豬（3.13%）、長白豬（40.62%）和大白豬（50%）為親本雜交培育的品種，繼承了馬身豬肉品質(zhì)好和抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點，而且生長速度顯著高于馬身豬。本研究以馬身豬和晉汾白豬為試驗動物，對這兩個品種的仔豬在出生后第1天（初生）、第28天（斷奶）和第70天（保育末期）三個時期糞便中的微生物進(jìn)行了16S rRNA測序，通過糞便微生物組成的變化情況分析仔豬糞便微生物的多樣性特點，為更深入地研究豬腸道微生物菌群的特征以及對動物生長發(fā)育影響的研究提供理論參考。

1? 材料與方法

1.1 試驗動物的飼養(yǎng)與樣品采集

按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的（NY/T 65-2004）《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》，統(tǒng)一將試驗動物飼養(yǎng)于山西省大同市種豬場。在組建豬群時，從馬身豬和晉汾白豬的母豬群中分別選擇年齡相同且體重接近的母豬進(jìn)行同期發(fā)情和配種，并在分娩前后封鎖不良的癥狀，喂給不含益生菌、抗生素或其他藥物的飼料。這些母豬所產(chǎn)的仔豬在初生、斷奶和保育末期按屠宰要求分別進(jìn)行屠宰（屠宰前禁食8 h，禁食期間可自由飲水）;在相同條件下，通過直腸擦拭法采集新鮮的糞便樣品，采集后將同品種、同日齡和同窩仔豬的樣品混合為一組，置于凍存管，在液氮中保存。兩個品種的每個采樣點的糞便樣品隨機(jī)抽取3份進(jìn)行16S rRNA測序分析。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和16S rRNA測序

按照QIAamp Fast DNA stool mini試劑盒（美國加利福尼亞州Qiagen公司）的操作說明，從200 μL糞便樣品中提取微生物基因組DNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中微生物16S rRNA基因的V3和V4區(qū)域[9]設(shè)計引物341F（5?-CCTAYGGGRBGCASCAG-3?）和806R（5?-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3?），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物利用Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行測序[10-11]。去除Raw data中含N>10%的序列，同時去除序列質(zhì)量低于80%的序列（Q-value>20）。利用FLASH軟件對序列進(jìn)行拼接，最小overlap長度為10 bp，overlap區(qū)允許的最大錯配率為0.2[12]。采用Trimmomatic軟件對拼接質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和數(shù)據(jù)優(yōu)化。

1.3 操作分類單元菌群聚類分析

使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME，version 1.17）[13]軟件對測序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，移除模糊堿基或者片段較大的片段末端讀數(shù)。利用Usearch（vsesion7.0）軟件[14]按照97%相似性對非重復(fù)序列進(jìn)行操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚類，基于Silva（https：//www.arb-silva.de/）數(shù)據(jù)庫[15]，對所得OTU在不同分類學(xué)水平上進(jìn)行注釋，生成結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 腸道微生物多樣性分析

利用Mothur（version v.1.30.1）[16]軟件計算物種微生物的α多樣性。表示微生物菌群豐富度的指數(shù)有Ace和Chao;計算微生物菌群多樣性的指數(shù)為Shannon;反映菌群系譜多樣性的指數(shù)是PD。利用T檢驗分析組間α多樣性的顯著性差異。使用97%相似度的OTU，利用R Studio（v.3.0.2）中工具制作稀釋曲線圖[17]?；诜羌訖?quán)的UniFrac（unweighted UniFrac）距離[18]和主成分分析（Principle co-ordination analysis，PCoA）計算樣品間的β多樣性。

1.5 微生物分類學(xué)分類及統(tǒng)計分析

根據(jù)對比SILVA細(xì)菌數(shù)據(jù)庫[15]（Release 128 http：//www.arb-silva.de）的結(jié)果，采用RDP classifier貝葉斯算法[19]對OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，然后在門（phylum）、綱（class）、目（order）、科（family）及屬（genus）水平上統(tǒng)計每個樣品中腸道微生物的組成。使用Wilcoxon秩和檢驗（Wilcoxon rank-sum test）對兩個品種豬的各個日齡及品種間微生物群落在屬水平上進(jìn)行假設(shè)檢驗，評估物種在豐度上存在的差異，分析組間顯著性差異。利用LEfSe軟件，根據(jù)分類學(xué)組成對樣品按照不同的分組條件進(jìn)行線性判別分析，獲得對兩個品種的仔豬各階段產(chǎn)生顯著影響的微生物屬。

2? 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA測序質(zhì)量評估

采用Mothur軟件進(jìn)行稀釋曲線分析，結(jié)果見圖1。

圖1分別呈現(xiàn)了樣品覆蓋率（coverage）和Sobs稀釋曲線。測序樣品的平均覆蓋率為97.82%，coverage和Sobs稀釋曲線趨向平坦并最終達(dá)到平臺期，說明測序數(shù)據(jù)能夠反映樣品中菌群多樣性信息可以滿足后續(xù)分析的要求。

2.2 OTU菌群聚類分析結(jié)果

通過OTU菌群聚類發(fā)現(xiàn)，本研究所得的OTU分屬25個門、43個綱、91個目、163個科和470個屬的微生物。測序樣品結(jié)果經(jīng)優(yōu)化處理后，共獲得938 912條有效序列，每個物種的平均有效序列數(shù)為52 162條，平均長度是436 bp。

2.3 不同豬種的仔豬糞便微生物α多樣性分析

晉汾白豬和馬身豬仔豬糞便微生物多樣性分析結(jié)果見圖2。

根據(jù)圖2中的Ace和Chao指數(shù)可知，兩個品種的仔豬糞便微生物的豐富度均在初生階段達(dá)到最高水平，且兩豬種間沒有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異（P>0.05），菌群豐度隨著仔豬日齡的增加呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，斷奶和保育階段菌群的豐度基本穩(wěn)定。圖2中的Pd指數(shù)表明，兩個品種的仔豬糞便微生物系譜多樣性在初生階段達(dá)到最高，且晉汾白豬的糞便微生物系譜多樣性高于馬身豬的，但差異不顯著（P>0.05），斷奶階段逐漸穩(wěn)定。根據(jù)圖2中的Shannon指數(shù)可知，兩個品種的仔豬糞便微生物菌群多樣性整體趨勢相似，均是在仔豬初生階段相對較低，且晉汾白豬糞便菌群多樣性在統(tǒng)計學(xué)意義上顯著高于馬身豬的（P<0.05）;與初生階段相比，兩豬種的仔豬斷奶時糞便菌群多樣性均在統(tǒng)計學(xué)意義上顯著增加（P<0.05）;與斷奶階段相比，保育階段的糞便菌群多樣性也呈增加的趨勢，但差異不顯著（P>0.05）。

2.4 糞便微生物主成分分析結(jié)果

基于加權(quán)UniFrac距離進(jìn)行了主成分分析，分析結(jié)果見圖3。

由圖3可知，第一主成分方向為菌群多樣性，占總變異的33.7%，從左向右依次為晉汾白豬和馬身豬第1日齡及28日齡的糞便樣品，然后是70日齡的糞便樣品。第二主成分為菌群均勻度，占總變異的14.89%。結(jié)果表明，年齡對豬糞便微生物多樣性有較大的影響，兩豬種1日齡仔豬的糞便微生物聚在一起，兩個品種仔豬28日齡和70日齡時的糞便微生物菌群多樣性更為相似。

2.5 不同品種微生物分類學(xué)分析

對兩個品種仔豬糞便中微生物門水平組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的細(xì)菌在兩個品種仔豬的3個生長階段的糞便中都存在，且隨著仔豬年齡的增長糞便微生物的豐度逐漸增加，變形菌屬（Proteobacteria）的細(xì)菌在仔豬初生階段的糞便中豐度較高，晉汾白豬和馬身豬仔豬糞便中的比例分別為46.67%和40.16%，隨著日齡增長逐漸下降（圖4）。

由圖4可知隨仔豬年齡的推移糞便微生物組成結(jié)構(gòu)在屬水平上存在顯著差異：初生時，糞便微生物豐度較高的細(xì)菌主要是梭狀芽孢桿菌1（Clostridium_sensu_stricto_1）、假單胞菌（Pseudomonas）和大腸桿菌志賀菌（Escherichia-Shigella）。晉汾白豬糞便中豐度最高的微生物是假單胞菌（32.33%），而馬身豬糞便中的假單胞菌僅為晉汾白豬的二分之一（16.89%）;馬身豬糞便中豐度最高的細(xì)菌是大腸桿菌志賀菌屬的細(xì)菌（27.14%），然而在晉汾白豬糞便中志賀菌屬細(xì)菌的豐度僅為馬身豬的二分之一（13.96%）。在仔豬的斷奶和保育階段，這些菌屬的細(xì)菌豐度極顯著降低，甚至消失;在斷奶階段，克里斯滕森菌科R-7屬（Christensenellaceae_R-7）細(xì)菌的豐度最高，約占糞便中總細(xì)菌的10.1%，隨后分別為擬桿菌屬（Bacteroidetes）細(xì)菌和乳酸桿菌（Lactobacillus），分別占7.57%和7.0%;在馬身豬上，斷奶時豐度最高的糞便微生物是乳酸桿菌，占總細(xì)菌的14.85%;其次是擬桿菌屬S24-7和紫單胞菌屬（Parabacteroides）的細(xì)菌，分別占11.08%和8.34%。在保育末期，兩個品種的仔豬糞便中乳酸桿菌和紫單胞菌屬細(xì)菌的豐度出現(xiàn)下降的趨勢，普雷沃氏菌NK3B31和普雷沃氏菌1的豐度相比斷奶階段的則逐漸增加，其中普雷沃氏菌是晉汾白豬糞便中豐度最高的細(xì)菌（10.03%），而普雷沃氏菌NK3B31為馬身豬糞便微生物中豐度最高的細(xì)菌（12.17%）。

2.6 不同品種腸道微生物腸型分析

兩個品種仔豬的糞便微生物腸型分析結(jié)果見圖5。

圖5表明，屬水平上的菌群分型結(jié)果表明優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)近似的樣品分別聚成三類。晉汾白豬和馬身豬在哺乳階段的糞便微生物主要是假單胞菌，斷奶階段是乳酸桿菌，保育階段是1型普雷沃氏菌。其中，假單胞菌和乳酸桿菌類群的樣品距離更遠(yuǎn)，1型普雷沃氏菌類群的樣品聚集得更為緊密。這三種腸型隨著仔豬的生長菌群聚類距離逐漸縮小，說明隨著仔豬年齡的增加兩個不變的腸道微生物差異逐漸縮小。

3? 討論

數(shù)以萬計的微生物棲息在動物腸道中并與宿主形成了互惠互利的關(guān)系，這些共生微生物被稱為微生物群[20]。平衡穩(wěn)定的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)是維持動物健康的重要條件，而微生物菌群的結(jié)構(gòu)與眾多的因素相關(guān)，如動物的品種、采食方式、生長環(huán)境和健康狀況等先天及后天因素的影響。有研究表明，不同品種的豬腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)組成差異顯著[21]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，母乳中的細(xì)菌最主要是厚壁菌門、鏈球菌門和擬桿菌門的細(xì)菌，在吮吸母乳的仔豬腸道中也檢測到了相同的菌群，從而證實了母乳對仔豬早期腸道微生物定植所起的作用[22]。不同品種的動物在相同的環(huán)境中生活數(shù)月之后，其腸道內(nèi)的微生物會因為采食方式的不同在微生物的組成和結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化[23-24]。本研究與上述研究結(jié)果相似，晉汾白豬和馬身豬的糞便微生物在初生階段因為品種的差異存在明顯的不同，但隨著年齡的不斷增加，采食和生長環(huán)境逐漸成為主導(dǎo)腸道微生物組成的主要因素，兩個品種仔豬的糞便微生物差異逐漸縮小，并最終趨于穩(wěn)定。

有研究表明，大腸埃希菌屬和志賀菌屬的細(xì)菌會造成動物的腹瀉，從而引發(fā)大規(guī)模的流行性疾病[25]。哺乳階段，梭桿菌門的細(xì)菌在兩個品種仔豬糞便中具有相對較高的豐度，它和一些致病菌常常存在于哺乳期的仔豬腸道內(nèi)，會引發(fā)腹瀉和腸炎等疾病[26]。對晉汾白豬和馬身豬的仔豬糞便微生物組成結(jié)構(gòu)及差異分析后發(fā)現(xiàn)，在初生階段，志賀菌屬細(xì)菌和假單胞菌在晉汾白豬和馬身豬的糞便中有較高的豐度。有研究發(fā)現(xiàn)給新生仔豬補(bǔ)充乳酸桿菌有助于動物的早期發(fā)育，并可通過調(diào)節(jié)新生仔豬腸道菌群的方式改善腸道健康，減少新生仔豬腸道中大腸桿菌和梭菌的數(shù)量，從而預(yù)防新生仔豬腹瀉[27-28]。哺乳階段到斷奶階段，仔豬的采食方式發(fā)生變化，由原來吮吸母乳轉(zhuǎn)為采食較難消化吸收的固態(tài)顆粒飼料，因此需要更多的能夠促進(jìn)動物消化的乳酸菌群。在此階段，仔豬腸道中乳酸桿菌類細(xì)菌的豐度逐漸升高。在本研究中，乳酸桿菌在仔豬哺乳期的腸道中豐度較小，隨著仔豬年齡的增長有所提高，說明早期飼喂乳酸桿菌有助于仔豬腸道細(xì)菌的穩(wěn)定，減少仔豬腹瀉等疾病的發(fā)生。普雷沃氏菌屬的細(xì)菌參與淀粉的降解，與葡萄糖代謝呈正相關(guān)，為動物機(jī)體提供生長發(fā)育所必需的能量，并且可以通過供能的方式來維護(hù)腸道健康[29]。擬桿菌屬S24-7科細(xì)菌能夠抑制動物腸道內(nèi)的炎癥反應(yīng)，在維護(hù)腸道健康上發(fā)揮著重要的作用[31]，有研究發(fā)現(xiàn)它與機(jī)體的能量代謝和丁酸鹽代謝密切相關(guān)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，保育期末期，晉汾白豬和馬身豬糞便中普雷沃氏菌屬細(xì)菌、擬桿菌屬S24-7細(xì)菌和毛螺菌科NK4A136細(xì)菌均達(dá)到一定的豐度水平且趨于穩(wěn)定，說明保育期末仔豬腸道微生物組成已基本趨于穩(wěn)定。

有研究表明，仔豬斷奶后因為較多地采食富含復(fù)合碳水化合物的谷類飼料，其腸腔內(nèi)的pH和發(fā)酵產(chǎn)物的生理特性受到了影響，這種變化可能是由于斷奶后腸道中普雷沃氏菌的數(shù)量不斷增加所致[21]。普雷沃氏菌屬的細(xì)菌有助于分解食物中的蛋白質(zhì)和碳水化合物，不僅參與宿主的多糖降解和氨基酸代謝，還能夠防御葡萄糖耐受不良，促進(jìn)肝糖原的儲存[33-34]。上述研究的結(jié)果與本研究中保育期仔豬糞便中普雷沃氏菌豐度較高的結(jié)果相一致。

本研究利用16S rRNA測序技術(shù)分析了晉汾白豬和馬身豬生長早期糞便微生物的多樣性特征，發(fā)現(xiàn)豬糞便微生物菌群的豐度和多樣性隨著豬年齡的增長而不斷變化。初生仔豬糞便微生物受母體和周圍環(huán)境的影響很大，導(dǎo)致這一時期假單胞菌屬和志賀菌屬等有害菌屬的細(xì)菌有比較高的豐度。隨著仔豬年齡的不斷增長，其腸道中有益菌逐漸占據(jù)優(yōu)勢，豐度提高，腸型也發(fā)生了改變。本研究的結(jié)果可為仔豬腸道微生物定植以及演替的變化規(guī)律提供理論參考。

參考文獻(xiàn)：（34篇，略）